循环ENO1作为早期乳腺癌诊断标志物：从胞外囊泡蛋白组学到临床液体活检新策略

《npj Precision Oncology》：Circulating enolase 1 as a diagnostic biomarker for early-stage breast cancer

本文针对早期乳腺癌诊断难题，研究团队通过分离血浆胞外囊泡（EVs）进行蛋白质组学分析，发现烯醇化酶1（ENO1）在早期患者血浆中显著升高，并经ELISA验证其诊断价值。该研究为开发无创液体活检提供了新靶点，对提升早期乳腺癌检出率具有重要意义。

　　

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，早期诊断对患者生存率至关重要。数据显示，早期（Ⅰ期）乳腺癌患者五年生存率可达99.4%，而晚期（Ⅳ期）骤降至30.1%。然而，传统影像学检查（如乳腺X线摄影）对微小肿瘤敏感度有限，且约80%的乳腺肿块为良性，导致大量不必要的穿刺活检，增加患者心理负担和医疗成本。液体活检技术通过检测血液中的肿瘤相关标志物，为无创诊断提供了新思路。但循环肿瘤细胞（CTCs）和肿瘤DNA（ctDNA）存在丰度低、检测成本高等局限。近年来，胞外囊泡（EVs）作为携带肿瘤特异性蛋白的“分子信使”，成为癌症标志物研究的热点。

本研究通过尺寸排阻色谱（SEC）分离健康者（19例）、良性乳腺疾病患者（19例）和Ⅰ期乳腺癌患者（86例）的血浆EVs，利用质谱技术筛选出94个差异表达蛋白。进一步分析术前术后配对样本（各9例）发现，烯醇化酶1（ENO1）在肿瘤切除后显著下降，提示其与肿瘤存在直接关联。团队采用高通量ELISA在更大队列（健康50例、良性19例、乳腺癌113例）中验证，显示ENO1在乳腺癌患者血浆中特异性升高（AUC=0.7864），且不受肿瘤分期或亚型影响。

关键实验方法概述

研究使用尺寸排阻色谱（SEC）从0.8μm过滤后的血浆中分离EVs，通过蛋白质印迹（Western blot）和电镜验证EVs纯度；采用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）进行蛋白质组学分析，并以酵母谷胱甘肽还原酶（GSHR）作为内标定量；最终通过酶联免疫吸附试验（ELISA）直接检测血浆ENO1浓度，临床样本来源于BC Cancer Biobank和London Tumor Biobank。

研究结果

1. 尺寸排阻色谱是血浆EV分离的最佳方法

比较SEC、聚乙二醇沉淀法和ExoQuick?-Ultra试剂盒发现，SEC能高效富集EV标志蛋白（CD9、CD63），且蛋白得率满足下游质谱需求。电镜显示SEC样本蛋白污染较少，GO分析证实其富集了ALIX、syntenin等EV典型蛋白。

2. Ⅰ期乳腺癌患者EV相关蛋白的质谱分析

质谱鉴定出73个在乳腺癌EVs中显著上调的蛋白（如补体系统、糖酵解通路相关蛋白），19个下调蛋白。热图显示乳腺癌患者EV蛋白谱与健康/良性组明显分离。通过术前术后样本对比，筛选出ENO1等12个肿瘤相关蛋白。

3. 验证ENO1作为Ⅰ期乳腺癌诊断标志物

ELISA证实ENO1在乳腺癌血浆中显著升高（p<0.001），术后水平下降。ROC曲线显示ENO1对所有分期乳腺癌均具诊断价值（AUC=0.7864），但单独用于区分良恶性时特异性有限（62.12%）。

结论与讨论

本研究首次系统证实血浆ENO1可作为早期乳腺癌的液体活检标志物。ENO1作为糖酵解关键酶，在肿瘤细胞中高表达，并通过EVs或蛋白冠形式进入循环。其诊断价值虽受限于组织泛表达特性，但结合影像学可能显著减少良性病变的过度活检。未来需联合多标志物提升特异性，并统一血样处理流程以降低预分析误差。该成果发表于《npj Precision Oncology》，为乳腺癌早期精准诊疗提供了新视角。