利用RNase抑制剂鸡尾酒延长未修饰RNA在活人细胞生理温度下的寿命实现细胞内NMR光谱分析

《Scientific Reports》：In-cell NMR spectra of chemically unmodified RNA at physiological temperature with extended lifetime through RNase inhibitor cocktail in living human cells

本研究针对活细胞内RNA易降解导致难以进行原子分辨率结构分析的难题，开发了一种通过引入RNase抑制剂鸡尾酒来显著延长RNA适体寿命的创新方法。研究人员成功在37°C生理温度下获得了HIV-1 Tat结合RNA适体及其与Tat肽复合物的完整细胞内NMR光谱，首次在生理条件下直接观测到U-A-U碱基三链体等关键结构特征。该方法无需化学修饰RNA，为在体研究RNA结构和相互作用提供了简单有效的技术平台，对RNA药物研发具有重要意义。

　　

在生命科学的微观世界里，核糖核酸（RNA）如同细胞内的精密机器，执行着各种关键功能。然而，要在活细胞的天然环境中观察这些"分子机器"的真实工作状态却异常困难。特别是在人类细胞内部，RNA分子面临着被无处不在的核糖核酸酶（RNase）迅速降解的命运，这就像试图在暴风雨中观察一朵娇嫩的花朵——往往还没来得及看清，它就已经凋零。

传统的细胞内核磁共振（in-cell NMR）技术虽然能够以原子分辨率研究生物大分子，但在RNA研究领域却举步维艰。以往科学家们不得不采取两种妥协方案：要么对RNA进行化学修饰以增强其稳定性，但这可能改变其天然性质；要么在低于生理温度的10°C下进行实验，这又无法反映RNA在正常体温下的真实状态。这些限制严重阻碍了我们对RNA在活细胞内结构和功能的深入理解。

面对这一挑战，来自京都大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项创新性研究，他们开发了一种简单而有效的方法，成功突破了活细胞内RNA研究的瓶颈。研究人员巧妙地使用了一种RNase抑制剂鸡尾酒，通过将两种具有互补作用谱的RNase抑制剂——SUPERase·In RNase Inhibitor和重组RNase Inhibitor混合使用，为RNA分子提供了全方位的保护。

这项研究选择了一个极具代表性的研究对象：一种能够高效结合HIV-1 Tat蛋白的RNA适体。这种RNA适体能够特异性识别Tat蛋白中的精氨酸富集 motif（49RKKRRQRRRPPQG61），并以极高的亲和力（解离常数K_d为10^-9 M）与之结合。尤为重要的是，当与Tat肽结合时，该RNA适体会形成特殊的U-A-U碱基三链体结构，这是理解其高效结合机制的关键。

关键技术方法概述

研究团队综合运用了多种先进技术方法：通过体外NMR验证了RNase抑制剂鸡尾酒不影响RNA结构；利用细胞裂解液NMR（in-lysate NMR）评估抑制剂对RNA稳定性的保护效果；采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳定量分析RNA在活细胞内的降解动力学；最关键的是，使用生物反应器系统进行细胞内NMR测量，通过持续灌注培养基维持细胞活性，确保信号真正来自活细胞内的RNA。所有实验均在37°C生理温度下进行，研究对象为HeLa细胞。

In vitro ¹H-NMR spectra of the aptamer_free and aptamer_complex in the presence and absence of the RNase inhibitor cocktail

研究人员首先评估了RNase抑制剂鸡尾酒对RNA适体NMR光谱的影响。通过在10°C、25°C和37°C下记录游离适体（aptamer_free）和复合物（aptamer_complex）的一维氢谱（1D ¹H-NMR），发现抑制剂鸡尾酒的加入仅因稀释作用导致信号强度轻微降低，并未引起明显的化学位移变化、新峰出现或谱线展宽。这表明RNase抑制剂鸡尾酒在这些条件下不会对RNA结构产生可检测的扰动，为后续细胞内实验奠定了基础。

Time course of in-lysate NMR spectra of the aptamer_free and aptamer_complex in the presence and absence of the RNase inhibitor cocktail

在细胞裂解液环境中，研究人员观察到了RNase抑制剂鸡尾酒的显著保护效果。未加抑制剂时，aptamer_free和aptamer_complex的亚氨基质子信号分别在2.5小时和3.0小时后完全消失，而加入抑制剂后，信号可分别持续到4.5小时和5.0小时。

Time course of degradation of the aptamer_free and aptamer_complex by denaturing gel electrophoresis in the presence and absence of the RNase inhibitor cocktail in living cells

变性凝胶电泳分析进一步证实了抑制剂在活细胞内的保护作用。未加抑制剂时，完整的RNA适体条带在3小时后变得模糊，4小时后完全消失；而加入RNase抑制剂鸡尾酒后，条带可清晰保持到5小时，直至6小时才消失。对于aptamer_complex，抑制剂同样将其可检测时间从3小时延长至5小时。

Time course of in-cell NMR spectra of the aptamer_free and aptamer_complex in the presence and absence of the RNase inhibitor cocktail at physiological temperature

最令人振奋的结果来自细胞内NMR实验。在37°C生理温度下，未加抑制剂时，aptamer_free的初始光谱就无法显示清晰的亚氨基质子信号，而aptamer_complex的信号也仅在1.5小时内可检测到。然而，加入RNase抑制剂鸡尾酒后，aptamer_free的所有亚氨基质子信号可稳定观测到6小时，aptamer_complex的信号在4小时时仍然清晰可见，甚至到7小时仍可检测。

特别值得注意的是，仅在加入抑制剂的情况下，才能在约14 ppm处（13.8 ppm和13.9 ppm）观察到U7和U23的亚氨基质子信号，这些信号对应于Tat肽结合位点处的两个U-A-U碱基三链体结构。这是首次在生理温度下直接证实RNA适体与Tat肽在活细胞内形成稳定复合物。

研究结论与意义

这项研究通过引入RNase抑制剂鸡尾酒，成功解决了活细胞内RNA研究面临的核心挑战——快速降解问题。该方法不仅显著延长了RNA在细胞内的寿命，使得在生理温度下进行长时间的细胞内NMR测量成为可能，而且无需对RNA进行任何化学修饰，保持了其天然状态。

研究的突破性意义体现在多个方面：技术上，为二维细胞内NMR研究（如¹H-¹⁵N HSQC和¹H-¹³C HSQC）奠定了基础，这将极大促进对细胞内RNA结构的深入解析；科学上，首次在生理温度下获得了游离状态RNA适体的细胞内NMR光谱，为了解其与配体的结合机制提供了关键信息；应用上，该方法简单易行、成本低廉，可广泛应用于功能性RNA（如核酶、microRNA、非编码RNA）以及RNA治疗方法（如siRNA和反义RNA）的研究。

尤为重要的是，该研究为基于RNA适体的抗HIV药物研发提供了坚实的技术支撑。通过在生理条件下直接观察RNA与靶标分子的相互作用，为合理设计高效RNA药物开辟了新途径。这项创新不仅深化了我们对RNA在细胞内行为的理解，也为未来RNA治疗领域的发展提供了强大的技术平台。