槲皮素包被的氧化铜-氧化锌掺杂纳米颗粒提升公羊精子冷冻复苏质量的研究

《Scientific Reports》：Quercetin-coated CuO–ZnO nanoparticles enhance post-thaw quality of ram semen

本研究针对公羊精子在冷冻复苏过程中因活性氧（ROS）过量产生导致质量下降的难题，创新性地将具有抗氧化活性的槲皮素（Quer）包被于氧化铜-氧化锌掺杂纳米颗粒（NCu-do-NZn-co-Quer）上，并添加入精液冷冻保护剂。结果表明，添加5 μg/mL的NCu-do-NZn-co-Quer能显著改善复苏后精子的活力、质膜功能、DNA完整性，并降低丙二醛（MDA）水平和异常率。该纳米复合物为改善家畜精液冷冻保存效果提供了新策略。

　　

在畜牧业中，人工授精（AI）技术是提升优良遗传性状和繁殖效率的关键手段。然而，精液在冷冻与复苏过程中难以避免地会遭遇“冷休克”，其中一个核心破坏因素便是过量产生的活性氧（ROS）。这些高活性分子会攻击精子脆弱的细胞膜、蛋白质和遗传物质DNA，导致精子活力下降、形态异常，最终使其受精能力大打折扣。因此，如何有效保护精子，帮助它们安然度过这场“冰火考验”，一直是生殖生物学领域的研究热点。

传统的抗氧化剂虽然有一定效果，但往往存在生物利用度低或稳定性差的问题。近年来，纳米技术的兴起为解决这一难题提供了新思路。纳米颗粒因其独特的物理化学性质，可作为优良的载体，提高抗氧化物质的递送效率和作用效果。其中，氧化锌纳米颗粒（NZn）和氧化铜纳米颗粒（NCu）本身已被证实具有抗氧化活性，而天然黄酮类化合物槲皮素（Quercetin, Quer）更是一种强效的抗氧化、抗炎剂。研究人员设想，如果能将这三者的优势结合起来，构建一种新型的纳米复合物，是否能像给精子穿上一件“纳米盔甲”，从而更有效地抵御冷冻复苏过程中的氧化损伤？

基于此，来自Razi大学的Saba Khodayari, Hadi Hajarian 和 Leila Soltani在《Scientific Reports》上发表了他们的研究成果。他们成功制备了槲皮素包被的氧化铜-氧化锌掺杂纳米颗粒（NCu-do-NZn-co-Quer），并系统评价了将其添加至公羊精液冷冻保护剂后，对精子复苏质量的改善效果。

为开展本研究，作者运用了几项关键技术：首先，他们通过能量色散X射线光谱（EDX）、场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）、紫外-可见光谱（UV-vis）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、Zeta电位和动态光散射（DLS）对合成的纳米颗粒进行了全面的表征，确认其形貌、元素组成、官能团、稳定性及尺寸。其次，他们建立了槲皮素的体外释放动力学实验方法。在生物学评价方面，研究以从Razi大学农学院羊场采集的Sanjabi公羊精液为样本，通过MTT法评估了不同添加物对新鲜精子的细胞毒性，并在冷冻复苏后，系统检测了精子的总活力、存活率、质膜功能（HOST法）、DNA完整性（吖啶橙染色）、形态异常率以及脂质过氧化终产物丙二醛（MDA）的水平。

表征NCu-do-NZn和NCu-do-NZn-co-Quer

研究人员首先对制备的纳米颗粒进行了详细表征。FE-SEM图像显示，NCu-do-NZn呈现不规则形态，而包被槲皮素后（NCu-do-NZn-co-Quer）其表面结构发生明显变化，表明槲皮素成功负载。

EDX分析证实了纳米颗粒中含有锌、铜、碳、氧等元素，负载槲皮素后碳、氧元素比例的变化进一步印证了包被的成功。

Zeta电位分析表明，NCu-do-NZn和NCu-do-NZn-co-Quer的电位分别为+18.3 mV和-22.3 mV，均处于稳定分散的范围（>±25 mV）。DLS显示，负载槲皮素后纳米颗粒的水合直径从约50 nm增加至195.6 nm。FT-IR光谱在NCu-do-NZn-co-Quer中检测到了槲皮素的特征吸收峰，证实了其成功结合。UV-vis光谱分析和计算显示，约有32.78%的槲皮素被成功包被到掺杂纳米颗粒上。体外释放实验表明，槲皮素在4小时内可从纳米颗粒中持续释放约24.8%。

不同浓度处理对新鲜公羊精子活力的细胞毒性评估

在将纳米材料用于冷冻保存前，需评估其对精子的安全性。MTT实验结果显示，在新鲜精液稀释液中添加5 μg/mL的NCu-do-NZn-co-Quer能显著提高精子代谢活性，表现出较低的细胞毒性。相反，当所有测试化合物（包括Quer、盐混合物、NCu-do-NZn及其复合物）的浓度达到最高（125 μg/mL）时，均对精子活力产生显著的抑制作用。这表明，适量浓度的NCu-do-NZn-co-Quer对精子是安全的，而高浓度则有害。

冷冻复苏后公羊精子质量参数评估

核心研究发现集中在冷冻复苏后的精子质量上。如表1和图9-14所示，在所有测试组中，添加5 μg/mL NCu-do-NZn-co-Quer的效果最为显著。

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  精子活力和存活率：该处理组的精子总活力（71.79%）和存活率（74.86%）均显著高于其他各组，包括单独使用Quer、NCu-do-NZn或它们的盐混合物。
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  质膜功能和DNA完整性：同样，5 μg/mL NCu-do-NZn-co-Quer处理组的精子质膜功能完整性（72.99%）和DNA完整性（95.79%）也达到了最高水平，表明该复合物能有效保护精子的关键结构和遗传物质。
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  精子形态异常和氧化损伤：此处理还显著降低了精子的总异常率（11.83%）和脂质过氧化标志物MDA的水平（21.89 nmol/mL），说明其能有效减轻氧化应激损伤。

相比之下，高浓度（125 μg/mL）的CuCl₂和ZnCl₂盐混合物对精子各项参数产生了明显的毒性效应。值得注意的是，适量浓度（如25 μg/mL）的单独Quer也表现出较好的保护效果，但均不及5 μg/mL的NCu-do-NZn-co-Quer复合物。这凸显了将纳米材料与天然抗氧化剂结合使用的协同增强效应。

研究结论与意义

本研究成功制备并表征了新型纳米复合物NCu-do-NZn-co-Quer。研究结果表明，在公羊精液冷冻保护剂中添加低浓度（5 μg/mL）的该复合物，能最有效地改善精子在冷冻复苏后的质量。其保护机制可能源于多个方面：槲皮素本身强大的直接清除ROS能力；锌和铜离子作为体内重要抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD）辅因子的作用；以及纳米颗粒作为载体提高槲皮素的稳定性和缓释特性，从而在冷冻复苏过程中提供持续的保护。这种“三重协同”抗氧化策略，相较于使用单一组分，在更低的浓度下实现了更优的效果，同时避免了高浓度可能带来的毒性。

该研究为家畜精液，特别是公羊精液的冷冻保存提供了一种新颖且高效的抗氧化剂方案。通过纳米技术增强天然抗氧化剂的功效，不仅有助于提高人工授精的成功率和后代质量，对保护畜禽遗传资源、促进畜牧业发展也具有重要的实践意义。未来研究可进一步探索其分子作用机制，并评估其对体内受精率和妊娠率的实际提升效果。