双氢青蒿素通过Nrf2–HO-1通路抑制Galectin-1诱导的胃癌铁死亡抵抗及腹膜转移的机制研究

《Phytomedicine》：Dihydroartemisinin inhibits galectin-1–induced ferroptosis resistance and peritoneal metastasis of gastric cancer via the Nrf2–HO-1 pathway

本研究针对胃癌腹膜转移（GCPM）防治难题，揭示了肿瘤微环境中Galectin-1通过激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信号通路诱导铁死亡抵抗的新机制，并首次发现双氢青蒿素（DHA）可通过靶向该通路有效抑制Galectin-1介导的腹膜转移，为GCPM的预防提供了新型治疗策略。

　　

胃癌是全球范围内常见的恶性肿瘤，其治疗面临巨大挑战，尤其是腹膜转移（Peritoneal Metastasis, PM）的发生，往往预示着患者预后极差。腹膜转移是胃癌最常见的扩散方式之一，在III期患者中发生率高达40%，但由于腹膜-血浆屏障的存在，化疗药物难以有效到达腹膜病灶，加之转移灶常伴随基因高度突变和对传统化疗的耐药性，一旦发生腹膜转移，治疗极为困难。因此，在腹膜转移发生前对高危患者进行预防性干预显得尤为重要。近年来，肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）在肿瘤发生发展中的作用日益受到关注。肿瘤微环境由基质细胞（如癌症相关成纤维细胞CAFs）、细胞因子和趋化因子等组成，它不仅能促进肿瘤细胞的定向迁移、增强其侵袭和转移能力，还能通过免疫编辑促进免疫逃逸。在胃癌微环境中，癌症相关成纤维细胞（CAFs）因其绝对数量优势而显得尤为重要。先前研究表明，CAFs高表达半乳糖凝集素-1（Galectin-1），这种表型能促进胃癌的发生、发展、侵袭和转移。然而，Galectin-1是否以及如何通过调控细胞死亡方式影响胃癌腹膜转移，其具体分子机制尚不完全清楚。

与此同时，铁死亡（Ferroptosis）作为一种铁依赖性的、以脂质过氧化物累积为特征的程序性细胞死亡方式，在肿瘤发展中扮演着复杂角色。虽然铁死亡通常被认为是一种抑癌机制，但某些肿瘤细胞能够通过获得铁死亡抵抗能力，进而促进其恶性生物学行为，如侵袭、迁移、克隆形成存活和耐药性。在胃癌腹膜转移模型中，铁死亡诱导剂已被证明能够抑制腹膜播散，这表明胃癌细胞的铁死亡抵抗在腹膜转移中起着关键作用。因此，靶向铁死亡已成为控制腹膜转移的一个有前景的策略。有研究显示，Galectin-1过表达可通过抑制脂质过氧化增强肝细胞癌的铁死亡抵抗，但其在胃癌中是否通过类似机制影响腹膜转移，尚未有报道。

在药物干预方面，寻找低毒高效的预防性药物是当前的研究热点。双氢青蒿素（Dihydroartemisinin, DHA）是中药青蒿素（Artemisinin）的活性代谢物，不仅是一种核心的抗疟疾药物，近年来还被发现具有显著的抗肿瘤和免疫调节等药理活性。前期研究提示DHA能够与顺铂（DDP）协同诱导胃癌细胞铁死亡，并能有效抑制动物模型中的胃癌腹膜转移。然而，DHA是否能靶向Galectin-1这一高危因子来抑制胃癌腹膜转移，目前尚无报道。

发表在《Phytomedicine》上的这项研究，旨在深入探究胃癌微环境中Galectin-1通过调控铁死亡促进腹膜转移的分子机制，并评估DHA作为该过程抑制剂的潜力，从而为预防胃癌腹膜转移提供新策略。

为开展此项研究，作者团队运用了多种关键技术方法。研究首先通过对132例胃癌患者临床样本的免疫组织化学（IHC）分析、数据库（GEPIA， TIMER）挖掘以及利用慢病毒转染的胃癌细胞构建的动物模型，探究了Galectin-1对胃癌腹膜转移的促进作用。通过转录组分析筛选Galectin-1促进腹膜转移的潜在通路，并利用临床标本分析及体内外实验进行验证。通过MTT法测定DHA对过表达LGALS1（编码Galectin-1）的胃癌细胞系的半抑制浓度（IC₅₀）。通过体外实验和体内动物模型干预，进一步证实DHA对Galectin-1诱导的胃癌腹膜转移的抑制作用及其机制。最后，采用分子对接实验初步探讨DHA抑制Galectin-1的机制。研究中涉及的细胞功能实验包括PI/钙黄绿素（calcein-AM/PI）染色、EdU增殖实验、Transwell迁移侵袭实验、平板克隆形成实验、MitoTracker线粒体染色、BODIPY^TM 581/591 C11脂质活性氧（ROS）检测、以及谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和丙二醛（MDA）水平测定。蛋白质表达水平通过蛋白质印迹（Western Blot, WB）和免疫荧光（Immunofluorescence, IF）进行检测。动物实验则构建了胃癌腹膜转移模型和皮下移植瘤模型，用于评估Galectin-1和DHA的体内效应。

Galectin-1在胃癌腹膜转移中扮演关键调控角色

通过对临床样本的免疫组化分析，研究人员发现，与无腹膜转移的胃癌组织相比，发生腹膜转移的胃癌组织中Galectin-1的表达水平显著更高。数据库分析进一步证实，LGALS1基因在胃癌组织中的表达水平显著高于正常组织，且其高表达与胃癌患者的不良预后（包括首次进展生存期、进展后生存期和总生存期缩短）显著相关。为了验证Galectin-1的功能，研究团队构建了敲低（KD-LGALS1）和过表达（OE-LGALS1）LGALS1的慢病毒载体，稳定转染人胃癌细胞系HGC-27，并建立了胃癌腹膜转移小鼠模型。实验结果显示，与野生型对照组相比，KD-LGALS1显著减少了小鼠腹膜转移结节的数量，而OE-LGALS1则导致转移结节数量显著增加。苏木精-伊红（H&E）染色确认这些结节均为腺癌组织。这些结果共同表明，Galectin-1是胃癌腹膜转移的一个关键调控因子。

Galectin-1促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移

为了探究Galectin-1影响胃癌细胞恶性表型的机制，研究人员进行了一系列体外功能实验。PI/钙黄绿素染色结果显示，KD-LGALS1降低了HGC-27和SGC-7901胃癌细胞的活力，而OE-LGALS1则抑制了细胞死亡。EdU增殖实验表明，KD-LGALS1抑制了细胞增殖，而OE-LGALS1促进了增殖。Transwell实验进一步证实，KD-LGALS1显著抑制了胃癌细胞的迁移和侵袭能力，OE-LGALS1则具有相反的促进作用。平板克隆形成实验也显示，KD-LGALS1损害了胃癌细胞的长期增殖和存活能力，而OE-LGALS1逆转了这一效应。这些数据说明Galectin-1能够增强胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

Galectin-1过表达抑制胃癌细胞铁死亡

研究人员通过MitoTracker染色观察线粒体形态，发现KD-LGALS1导致线粒体嵴减少或完全消失，而细胞核形态未受影响，提示发生了铁死亡；OE-LGALS1则减轻了铁死亡相关变化。BODIPY C11染色检测脂质活性氧（ROS）水平，结果显示KD-LGALS1显著增加了脂质ROS的产生，而过表达则相反。生化指标检测发现，KD-LGALS1导致细胞内GSH和GSH-PX水平下降，MDA水平升高，表明脂质过氧化增强；这些效应在OE-LGALS1后被逆转。这些结果综合表明，Galectin-1通过抑制铁死亡来阻止胃癌细胞死亡。

Galectin-1增强胃癌细胞对铁死亡的抵抗能力

为了进一步确认Galectin-1通过抑制铁死亡来促进胃癌细胞增殖，研究人员用铁螯合剂去铁胺（DFO）处理细胞并进行克隆形成实验。结果显示，DFO诱导的增殖效应可被KD-LGALS1有效抵消。同样，当应用铁死亡诱导剂Erastin时，OE-LGALS1减轻了Erastin的抗增殖作用。MitoTracker和BODIPY C11染色结果也验证了DFO抑制铁死亡而KD-LGALS1部分逆转此抑制，Erastin显著诱导铁死亡而OE-LGALS1赋予抵抗能力。这些实验发现进一步证实了Galectin-1能够增强胃癌细胞的铁死亡抵抗。

基因组分析揭示OE-LGALS1 HGC-27细胞中差异表达基因及信号通路

通过对野生型和OE-LGALS1 HGC-27细胞进行高通量转录组分析，研究人员发现OE-LGALS1导致81个基因显著下调，278个基因显著上调。其中，与铁死亡密切相关的HMOX1（编码血红素氧合酶-1, HO-1）上调最为显著。基因本体（GO）富集分析显示，上调基因主要富集于细胞迁移、细胞外基质组织等生物过程。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析表明，OE-LGALS1调控的信号通路包括MAPK和PI3K–Akt通路，其中PI3K–Akt信号通路富集最为显著，提示其可能介导了Galectin-1诱导的铁死亡抵抗。

Galectin-1通过β1-整合素激活PI3K/Akt信号通路并促进Nrf2转录

体外功能实验验证了基因组筛选的结果。蛋白质印迹分析显示，KD-LGALS1显著抑制了SGC-7901和HGC-27细胞中PI3K/Akt通路的活化，而OE-LGALS1则促进了该通路的活化。在OE-LGALS1的胃癌细胞中双转染β1-整合素小干扰RNA（si-β1-integrin）后，干扰β1-整合素的表达能显著减弱OE-LGALS1诱导的PI3K/Akt活化，表明Galectin-1通过跨膜受体β1-整合素激活PI3K/Akt信号通路。核因子E2相关因子2（Nrf2）是激活HMOX1转录的关键因子。免疫荧光染色显示，KD-LGALS1显著降低了胃癌细胞中Nrf2的表达，而OE-LGALS1则显著增加了Nrf2的水平。对患者胃癌组织的免疫荧光染色也发现，伴有腹膜转移的胃癌组织中Galectin-1、p-PI3K、p-Akt和Nrf2的表达水平均显著高于无转移组织。

抑制Nrf2蛋白表达可减弱Galectin-1介导的铁死亡抵抗增强

蛋白质印迹分析显示，KD-LGALS1降低了胃癌细胞中HO-1和GPX4的蛋白表达水平，而OE-LGALS1则增加了这些蛋白的表达。为了确认LGALS1通过Nrf2通路增强HMOX1 mRNA转录，研究人员用特异性Nrf2抑制剂ML385处理OE-LGALS1胃癌细胞。细胞免疫荧光染色证实，ML385有效抑制了LGALS1过表达引起的Nrf2、HO-1和GPX4表达增加。BODIPY C11染色显示，抑制Nrf2显著减弱了OE-LGALS1后观察到的铁死亡抵抗增强。这表明Galectin-1通过Nrf2通路增强铁死亡抵抗。

Nrf2/HO-1/GPX4高表达抑制铁死亡并促进胃癌腹膜转移

数据库分析表明，NFE2L2（编码Nrf2）、HMOX1和GPX4在胃癌组织中显著过表达，且高表达与患者不良预后相关。蛋白质印迹分析验证了14对匹配的胃癌组织及癌旁组织中Nrf2、HO-1和GPX4的表达水平，发现癌组织中这些蛋白的表达显著升高。对患者组织的免疫荧光染色显示，伴有腹膜转移的胃癌组织中Nrf2、HO-1和GPX4的表达水平显著高于无转移组织。铁染色及转铁蛋白受体1（TfR1）和铁转运蛋白（FPN1）的免疫组化检测发现，腹膜转移组织中的铁沉积显著减少，TfR1表达明显降低，而FPN1表达增加。这些临床数据证实了Nrf2/HO-1/GPX4轴在胃癌铁死亡抵抗和腹膜转移中的重要作用。

Galectin-1通过激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1/GPX4信号通路抑制铁死亡并促进胃癌腹膜转移

通过在胃癌腹膜转移模型小鼠中检测转移结节，研究人员全面阐明了Galectin-1调控PI3K/Akt信号通路增加Nrf2转录，进而促进HO-1表达，并与GPX4协同增强胃癌细胞铁死亡抵抗，从而促进腹膜转移的机制。免疫组化结果显示，OE-LGALS1导致腹膜转移灶中Galectin-1高表达，同时p-PI3K、p-Akt、Nrf2和HO-1的表达也增加。结合铁染色和TfR1、FPN1、GPX4的检测结果，证实了Galectin-1激活PI3K/Akt通路，增加Nrf2/HO-1/GPX4表达，增强铁死亡抵抗，促进胃癌腹膜转移。

小鼠皮下肿瘤模型表明抑制Nrf2/HO-1可诱导铁死亡并抑制肿瘤生长

利用OE-LGALS1 HGC-27细胞建立裸鼠皮下肿瘤模型并给予Nrf2抑制剂，进一步验证了Nrf2/HO-1信号在胃癌铁死亡中的调控作用。结果显示，OE-LGALS1显著加速了皮下肿瘤的生长，而Nrf2抑制则明显抑制了肿瘤发展。免疫组化证实OE-LGALS1增加了皮下肿瘤组织中Galectin-1、p-PI3K、p-Akt、Nrf2和HO-1的表达。ML385处理后，PI3K/Akt通路的活化未受影响，但Nrf2和HO-1表达水平显著降低。H&E染色、铁染色及TfR1、FPN1、GPX4的免疫组化证实OE-LGALS1抑制了铁死亡，而Nrf2抑制部分逆转了这一效应。

体外实验证明DHA以浓度依赖性方式抑制Galectin-1诱导的铁死亡抵抗

CCK-8实验评估了DHA的细胞毒性作用，结果显示DHA对OE-LGALS1胃癌细胞的抑制作用呈时间和浓度依赖性。MitoTracker染色证实DHA能有效拮抗Galectin-1诱导的铁死亡抵抗，且呈剂量依赖性。BODIPY C11染色显示DHA促进了OE-LGALS1胃癌细胞中脂质ROS的累积。PI/钙黄绿素染色结果证实DHA有效诱导了OE-LGALS1胃癌细胞的死亡。克隆形成实验表明DHA显著抑制了OE-LGALS1胃癌细胞的增殖。

DHA通过PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路在体外抑制Galectin-1促进的胃癌腹膜转移

通过将钙黄绿素标记的胃癌细胞与人腹膜间皮细胞（HMrSV5）共培养模拟体外腹膜转移黏附过程，发现OE-LGALS1显著增强了细胞黏附，而DHA处理则以浓度依赖的方式抑制了这一过程。鉴于之前发现DHA能逆转Galectin-1诱导的铁死亡抵抗，细胞免疫荧光染色评估了DHA是否通过下调Nrf2/HO-1来促进铁死亡。结果显示，DHA以剂量依赖的方式抑制了Nrf2和HO-1的表达。蛋白质印迹分析OE-LGALS1胃癌细胞及DHA干预后的PI3K/Akt通路蛋白、Nrf2/HO-1及GPX4，发现DHA显著影响了Galectin-1的表达，并抑制了PI3K/Akt的活化及其下游蛋白的表达。

DHA在体内通过PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路抑制腹膜转移

通过建立野生型和OE-LGALS1 HGC-27细胞的胃癌腹膜转移模型并给予DHA处理，发现DHA显著抑制了LGALS1介导的腹膜转移。H&E染色确认了腺癌形态，铁染色及TfR1、FPN1、GPX4的免疫组化证实DHA处理促进了铁死亡。对腹膜转移结节的免疫组化显示，DHA显著改变了Galectin-1的表达，并抑制了PI3K/Akt活化及Nrf2/HO-1表达。这些体内结果与体外观察一致，证实DHA通过PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路抑制腹膜转移。

此外，分子对接实验为阐明DHA抑制Galectin-1的机制提供了初步见解。结果显示，DHA与Galectin-1以及其上游调控因子缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）均能结合，并形成多个氢键和盐桥相互作用，提示DHA可能通过直接作用于Galectin-1或间接通过抑制HIF-1α来发挥效应。

研究结论与意义

本研究首次提供了证据表明，胃癌微环境中的Galectin-1通过激活PI3K/Akt–Nrf2–HO-1轴，上调GPX4表达，从而增强胃癌细胞的铁死亡抵抗能力，最终促进腹膜转移。同时，研究首次发现双氢青蒿素（DHA）能够靶向这一通路，通过下调Galectin-1表达、抑制PI3K/Akt信号传导、减少Nrf2核转位及HO-1/GPX4表达，有效逆转铁死亡抵抗，抑制胃癌腹膜转移。分子对接结果进一步提示DHA可能直接与Galectin-1或其上游调控因子HIF-1α相互作用。

这项研究不仅揭示了Galectin-1在胃癌腹膜转移中通过调控铁死亡发挥作用的新机制，拓展了对肿瘤微环境与细胞死亡方式交互作用的理解，而且为临床预防和治疗胃癌腹膜转移提供了新的潜在靶点和策略。DHA作为一种已知安全性较好的药物，其在此领域的应用潜力值得进一步深入探索。尽管肿瘤微环境中免疫细胞等其他组分对铁死亡的调控、以及DHA耐药背景下克服铁死亡抵抗的策略等仍是未来需要面对的风险与挑战，但本研究无疑为攻克胃癌腹膜转移这一难题开辟了新的思路和方向。