NR4A1表达异常导致胃癌放疗抵抗的作用机制与临床意义研究

《Scientific Reports》：NR4A1 expression aberrations contribute to radiotherapy resistance in gastric cancer

本研究针对胃癌放疗抵抗这一临床难题，通过建立放疗抵抗细胞模型，发现核受体NR4A1在放疗抵抗细胞中表达显著下调。研究人员通过功能实验证实，过表达NR4A1可增强胃癌细胞对放射线的敏感性，抑制细胞增殖和转移，其机制可能与调控p53通路和EMT过程相关。该研究为克服胃癌放疗抵抗提供了新的潜在靶点。

　　

胃癌是全球范围内常见的致命性恶性肿瘤，多数患者在确诊时已处于晚期阶段。尽管手术治疗是早期胃癌的常用方法，但对于局部晚期和晚期肿瘤患者，单纯手术往往效果有限。在临床实践中，局部晚期和晚期胃癌通常需要采用多模式治疗策略，包括手术联合化疗、放化疗、围手术期化疗或放化疗等。然而，超过50%的患者在根治性切除后会出现局部复发。

多年来，胃癌的治疗模式不断演变，放疗在其治疗中逐渐得到探索。但放疗效果并不总是令人满意。尽管学界已经努力识别放疗抵抗的分子决定因素，但其潜在机制仍未完全阐明，这一知识缺口严重制约了治疗效果的提升。迄今为止，关于胃癌放疗抵抗分子机制的研究仍然有限，因此深入了解胃癌放疗抵抗的分子机制具有重要的临床意义。

核受体是一类转录因子家族，已成为与致癌过程相关的关键分子调节因子。这些过程包括细胞凋亡、DNA修复、增殖和迁移等，共同促进了癌症发展的复杂性。核受体4A组成员1（NR4A1，也称为Nur77、TR3）是该家族中的关键转录因子。大量研究表明，NR4A1参与多种肿瘤过程，通常发挥肿瘤抑制作用，涉及胃癌、急性髓系白血病、乳腺癌和转移性卵巢癌等多种癌症。有趣的是，最近的研究表明NR4A1与多种癌症类型的治疗抵抗有关。例如，在前列腺癌中，NR4A1下调与多西他赛化疗抵抗相关；而在肝细胞癌中，其过表达使肿瘤对辐射更敏感。这些发现表明NR4A1可能在治疗反应通路中起关键作用，但其在胃癌放疗抵抗中的具体作用尚未得到系统研究。

本研究通过在胃癌细胞系MKN45和AGS中诱导放疗抵抗，建立了放疗抵抗变体MKN45-R和AGS-R细胞。通过高通量测序技术获取了与放疗抵抗相关的mRNA表达谱，qRT-PCR和Western blot分析显示NR4A1在放疗抵抗细胞中的表达显著降低。研究人员通过过表达NR4A1探索了其在胃癌放疗抵抗中的功能，发现NR4A1过表达能够增强放疗抵抗细胞对辐射的敏感性，促进细胞凋亡，并抑制体内外肿瘤的生长和转移。

主要技术方法包括：通过梯度照射法建立放疗抵抗细胞模型；采用CCK-8法和克隆形成实验评估细胞增殖和辐射敏感性；通过流式细胞术分析细胞凋亡；使用qRT-PCR和Western blot检测基因和蛋白表达；通过Transwell和小室实验评估细胞迁移和侵袭能力；建立裸鼠皮下移植瘤和肺转移模型进行体内功能验证。

MKN45-R和AGS-R放疗抵抗细胞的建立及其放疗抵抗能力的验证

研究人员采用经典胃癌细胞系MKN45和AGS，通过分段剂量梯度照射（2,2,4,4,6,6,8,8,10,10 Gy）历时5个月成功建立了放疗抵抗细胞系MKN45-R和AGS-R。克隆形成实验显示，照射后MKN45-R和AGS-R细胞集落存活率更高，集落更大。CCK-8实验表明，在4 Gy或更高剂量照射下，放疗抵抗细胞与亲本细胞的生长出现显著差异。生存曲线数据分析显示，放疗抵抗细胞的放射抵抗指标包括37%剂量斜率（D₀）、准阈剂量（D）、平均失活剂量（MID）和2 Gy照射下的存活分数（SF2）均有所增加。

NR4A1在MKN45-R和AGS-R细胞中的表达较亲本细胞降低

通过高通量mRNA测序分析放疗抵抗细胞与亲本细胞的差异表达谱，发现151个下调mRNA和80个上调mRNA。其中NR4A1在放疗抵抗细胞系中显著下调约2.5倍，经qRT-PCR和Western blot实验验证。这一发现表明NR4A1可能在胃癌获得性放疗抵抗中发挥作用。

NR4A1在MKN45-R和AGS-R细胞中的异位表达可增强其辐射敏感性

通过在放疗抵抗的胃癌细胞中诱导NR4A1过表达，研究发现NR4A1过表达显著降低了MKN45-R和AGS-R细胞在6 Gy辐射下的存活率。细胞凋亡评估显示，NR4A1过表达使照射后细胞凋亡率显著增加。Western blot分析表明，NR4A1过表达显著提高了p53和cleaved caspase-3的蛋白表达水平，同时显著提高了Bax/Bcl-2比值。这些发现表明NR4A1通过激活内在凋亡途径增强辐射诱导的细胞死亡。

NR4A1在体外和体内促进GC细胞转移

Transwell实验显示，NR4A1过表达显著降低了AGS-R和MKN45-R细胞的侵袭能力。伤口愈合实验中，NR4A1过表达组在6 Gy辐射后迁移率明显增强。Western blot分析表明，NR4A1过表达显著上调E-钙黏蛋白表达，同时下调N-钙黏蛋白和波形蛋白水平，提示NR4A1对上皮-间质转化（EMT）过程具有抑制作用。

NR4A1在体内抑制GC细胞增殖和转移

通过建立皮下肿瘤和肺转移模型，研究发现NR4A1过表达组在辐射下肿瘤重量显著减轻，Ki-67表达水平降低。尾静脉注射稳定转染细胞后，NR4A1过表达小鼠肺转移显著减少，证实了NR4A1在体内对胃癌转移的抑制作用。

本研究结果表明，NR4A1在胃癌放疗抵抗中发挥关键作用。辐射诱导的NR4A1下调可能是胃癌放疗抵抗发展的关键因素。NR4A1通过调控p53通路和EMT过程增强胃癌细胞对辐射的敏感性，抑制肿瘤生长和转移。这些发现为克服胃癌放疗抵抗提供了新的潜在靶点，具有重要的临床转化价值。未来研究将着重阐明NR4A1增强胃癌细胞辐射敏感性的具体分子机制，特别是其在DNA修复调控中的矛盾角色，以及NR4A1作为放疗增敏靶点在胃癌放疗中的临床应用前景。