卫生条件通过调节IL-10/IL-12p40平衡调控肉鸡对LPS挑战的炎症免疫反应

《Powder Technology》：IMMUNOMODULATION BY SANITARY CONDITIONS Sanitary Conditions Modulate Proinflammatory Cytokine Response Of Broilers

本研究探讨了不同卫生条件（HSC与LSC）对肉鸡免疫反应的调控作用。研究人员通过呼吸道LPS挑战模型，发现LSC诱导肉鸡产生更强的抗炎反应，表现为单核细胞产生更高水平的IL-10和更低水平的IL-12p40，导致IL-10:IL-12比率显著升高。这项研究揭示了环境因素通过调节先天免疫反应影响动物健康的新机制，为改善家禽养殖管理提供了重要理论依据。

　　

在现代化的家禽养殖业中，动物的健康和生产性能深受其生活环境的影响。其中，卫生条件是一个关键因素，它直接决定了动物所接触的抗原负荷，尤其是细菌及其成分的暴露水平。低卫生条件（LSC）通常意味着更高的细菌抗原压力，这已被证明会影响动物的生长发育和免疫系统功能。例如，先前的研究表明，在LSC下饲养的猪和鸡，其体重增长会减缓，同时血浆或血清中的天然抗体水平会升高。然而，这些研究大多聚焦于体液免疫反应，即抗体应答的变化，而对于卫生条件如何影响机体的细胞免疫反应，特别是炎症反应的核心环节——细胞因子的产生和调控，人们仍知之甚少。这就像一个黑箱：我们知道不良环境会影响动物的整体健康状态，但对其内部免疫系统的具体运作方式，尤其是炎症与抗炎平衡的微妙变化，缺乏深入的理解。

为了解决这一科学问题，来自荷兰瓦赫宁根大学与研究中心的Paulina Krzysica、Maarten Hollemans、Aart Lammers、Coen Smits、Huub F.J. Savelkoul、Sonja de Vries和Edwin Tijhaar等研究人员开展了一项深入研究。他们以肉鸡为模型，旨在揭示不同卫生条件（高卫生条件HSC与低卫生条件LSC）如何调节肉鸡在经历呼吸道脂多糖（LPS）挑战后的炎症免疫反应。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的成分，是一种强大的免疫刺激剂，能通过Toll样受体4（TLR4）激活先天免疫细胞，引发炎症因子风暴，是研究炎症反应的经典模型。这项研究的意义在于，它试图从细胞因子水平阐明环境压力影响动物健康的内在免疫学机制，这对于理解动物在亚临床健康状态下的免疫适应，以及制定更科学的养殖管理策略具有重要价值。相关研究成果发表在《Powder Technology》上。

为了完成这项研究，作者团队运用了几个关键的技术方法。研究首先利用白来航鸡的外周血单核细胞（PBMCs）进行体外LPS刺激实验，以确定体内实验检测细胞因子的最佳时间点。核心的动物实验则采用2×2因子设计，将罗斯308雄性肉鸡分别饲养于人工气候呼吸舱（CRC）模拟的HSC和LSC环境中。LSC通过定期撒播来自商业农场的旧垫料来实现。在肉鸡33日龄时，对其进行气管内（i.t.）LPS挑战，并在挑战前（0小时）及挑战后（6、24、48小时）采集血浆样本。在48小时，还采集血液用于分离单核细胞并进行离体LPS刺激。细胞因子的定量检测均采用研究团队之前建立的捕获ELISA（酶联免疫吸附试验）方法。数据分析使用了R语言和GraphPad Prism进行统计学处理，包括ANOVA（方差分析）、Kruskall-Wallis检验和Mann-Whitney检验等。

Cytokine Production After Stimulation of PBMCs with LPS and PWM

为了确定体内LPS挑战后检测血浆细胞因子的合适时间点，研究人员先进行了体外实验，观察了白来航鸡PBMCs在LPS和美洲商陆有丝分裂原（PWM）刺激下细胞因子的产生动态。结果显示，PWM能强烈诱导IL-2、IL-6、IL-12p40和IFN-γ的产生，这些细胞因子在培养上清液中的浓度在刺激后48小时达到峰值。LPS同样能诱导IL-6（从4小时开始）和IFN-γ（48小时）的产生。无论是LPS还是PWM刺激，均未显著升高IL-10的水平。这项预实验表明，在体外刺激后48小时能观察到最显著的细胞因子反应，这为后续体内实验的采样时间点选择提供了依据。

Sanitary Conditions Influence the Plasma Levels of IFN-γ and IL-10

研究人员接着分析了不同卫生条件下饲养的肉鸡在气管内LPS挑战前后血浆中的细胞因子水平。结果发现，在LPS挑战之前（0小时），LSC组肉鸡血浆中的IFN-γ水平就显著高于HSC组。这种差异在LPS挑战后6小时和24小时依然存在，但到了48小时，两组间的差异不再显著。与此形成对比的是，IL-10的水平在挑战早期（0、6、24小时）两组间无差异，但在48小时时，LSC组肉鸡的IL-10水平显著高于HSC组。其他细胞因子如IL-2、IL-6和IL-12p40的血浆浓度在不同卫生条件间未见显著差异。这表明，LSC使得肉鸡在基线状态和LPS挑战早期具有更强的Th1型免疫反应（以高IFN-γ为特征），而在挑战后期则转向更高的抗炎反应（以高IL-10为特征）。

Ex vivo LPS-stimulated Monocytes From Broilers Kept Under LSC Produce Reduced Levels of IL-12p40 and Elevated Levels of IL-10

为了更深入地了解先天免疫细胞的功能状态，研究者在LPS挑战48小时后分离了肉鸡血液中的单核细胞，并在体外再次用LPS进行刺激。离体实验结果显示，来自LSC组肉鸡的单核细胞，无论是否经过LPS再刺激，其产生的促炎细胞因子IL-12p40水平均显著低于HSC组。相反，在LPS刺激下，LSC组单核细胞产生的抗炎细胞因子IL-10水平则显著高于HSC组。IL-6的产生在两组间没有差异。最关键的计算结果是IL-10与IL-12p40的比值：LSC组单核细胞的该比值比HSC组高出近40倍。这清晰地表明，经历LSC环境的肉鸡，其先天免疫细胞（单核细胞）在应对二次LPS刺激时，表现出强烈的抗炎表型。

在讨论部分，研究人员对上述发现进行了深入的综合分析。他们指出，本研究的核心发现是LSC条件调控了肉鸡的免疫反应，使其在面对LPS挑战时表现出一种向抗炎方向倾斜的免疫表型。这种调控体现在多个层面：在体水平上，LSC肉鸡在LPS挑战后期（48小时）血浆IL-10水平升高；在离体细胞水平上，其单核细胞产生更少的促炎因子IL-12p40和更多的抗炎因子IL-10，导致IL-10:IL-12比率急剧增高。尽管在挑战初期LSC肉鸡表现出更高的IFN-γ水平（提示其体内可能存在更多因持续抗原暴露而活化的Th1细胞或NK细胞），但随后的免疫反应似乎被有效约束。

研究人员探讨了导致这种抗炎表型的潜在机制。一种可能性是脂多糖耐受（LPS tolerance）的形成。由于LSC肉鸡长期暴露于含有高浓度LPS等细菌抗原的旧垫料中，其免疫系统可能适应了这种持续刺激，从而在对后续LPS挑战时产生减弱的促炎反应和增强的抗炎反应（如IL-10），这是一种避免过度炎症损伤的保护机制。另一种可能的机制涉及调节性T细胞（Treg）的活性。观察到的体内IL-10升高可能部分源于Treg，它们通过分泌IL-10来抑制过度的免疫反应。单核细胞功能的改变（产生更多IL-10，更少IL-12）本身也是这种抗炎调节的重要组成部分。IL-10能够反馈抑制IL-12的产生并调控IFN-γ反应，从而有助于将免疫反应控制在适度范围内。

研究人员也将自己的发现与既往研究进行了对比和联系。他们特别提到，一项由Roque等人开展的研究发现，饲养环境灰尘中内毒素水平高的鸡，其PBMCs在ConA（刀豆蛋白A，一种T细胞丝裂原）刺激下产生的IFN-γ反而更低。这看似与本研究LSC肉鸡体内基础IFN-γ更高的结果矛盾，但实际上可能反映了不同的免疫细胞激活状态。Roque等人检测的是所有T细胞被非特异性激活后的IFN-γ产生能力，其结果可能更反映了细胞整体的反应潜能，而本研究检测的体内IFN-γ水平可能更准确地反映了在特定抗原压力下体内已激活的Th1细胞的实际状态。两者共同提示，LSC或高内毒素环境可能一方面导致体内部分T细胞因抗原刺激而激活（高IFN-γ），另一方面又使免疫系统整体倾向于抑制性/耐受状态（离体再刺激时反应性降低）。

最后，研究人员总结了本研究的重要意义，并指出了未来的研究方向。他们强调，LSC诱导的免疫反应向抗炎方向偏移，可能是一把双刃剑。一方面，这种调节可能有助于限制由持续细菌抗原暴露和偶尔的病原挑战引起的免疫病理损伤，对维持机体稳态有积极作用。但另一方面，过于强烈的抗炎环境可能会削弱机体清除病原体的能力。因此，一个关键的、有待解答的问题是：这种由LSC诱导的抗炎免疫表型，是否会增加肉鸡对未来实际感染的易感性？未来的研究需要通过直接的病原攻毒实验来验证这一假设，从而更全面地评估不同卫生管理策略对家禽健康和生产的影响。总之，这项研究从细胞因子水平深化了我们对环境因素如何塑造动物免疫状态的理解，为动物免疫学和环境免疫学提供了新的见解。