AsKslB介导Pictet-Spengler反应中亚胺离子中间体的结构与功能解析及其催化机制研究

《Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology》：Structural and functional insights into the iminium ion intermediate in AsKslB-mediated Pictet-Spengler reaction

本研究针对Pictet-Spenglerase（PSase）催化关键中间体结构信息缺失的难题，聚焦于从稀有放线菌中发现的Pictet-Spenglerase AsKslB。研究人员通过解析其apo、底物结合、中间体（IM-1）及产物（KA）结合状态的高分辨率晶体结构，首次捕获了难以捉摸的亚胺离子中间体IM-1及其同步释放的水分子，揭示了完整的催化轨迹和关键残基（如Glu276的构象变化），阐明了PSR的立体选择性环化起始步骤的分子机制。该研究为理解PSase功能提供了详尽的机理见解，并确立了AsKslB作为立体选择性N-杂环合成生物催化剂的潜力。

　　

在生物活性生物碱和药物的生物合成中，Pictet-Spengler反应（PSR）扮演着至关重要的角色。该反应能够高效地构建复杂的含氮杂环骨架，是许多具有重要生理活性的天然产物的关键合成步骤。然而，尽管其在有机合成和生物合成中应用广泛，其酶催化（由Pictet-Spenglerase, PSase催化）过程中的关键结构细节，尤其是反应起始阶段形成的短暂中间体——亚胺离子（iminium ion intermediate）的结构，长期以来一直未被直接观测到，这限制了对PSase催化机制的深入理解和理性改造。目前，仅有四种PSase（植物来源的STR、NCS以及稀有放线菌来源的McbB和KslB）被生化与结构生物学手段充分表征，其中KslB因其能够高效、高立体选择性地催化L-色氨酸（L-Trp）与α-酮戊二酸（α-KG）缩合生成1,1-二取代四氢-β-咔啉（THβC）类化合物，并展现出广泛的底物杂泛性和与级联反应的兼容性，而成为挖掘新型PSase和探究催化机制的理想探针。因此，以KslB为标记，从稀有放线菌资源中持续挖掘新的同源PSase，并解析其催化过程中的关键中间体结构，对于拓展可用工具酶库和揭示PSR的精确机理具有迫切需求和重要意义。本研究正是在此背景下，报道了来自Actinosynnema sp. ALI-1.44的新型PSase——AsKslB的发现及其催化PSR的完整机制。该研究成果发表于《Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology》。

为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术：蛋白质表达与纯化（利用pET-28a(+)载体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达N端6×His标签融合的AsKslB，并通过镍柱亲和层析等方法纯化）、酶学活性测定与动力学分析（通过高效液相色谱HPLC监测反应进程，优化反应条件如pH、温度，并评估底物特异性）、位点定向突变（构建了13个AsKslB突变体以研究关键残基功能）以及X射线晶体学（通过悬滴法和坐滴法蒸汽扩散法获得apo、L-Trp结合、中间体IM-1结合和产物KA结合的AsKslB晶体，在上海同步辐射光源收集衍射数据，并利用分子置换法解析高分辨率晶体结构）。

3.1. AsKslB的生化表征

研究人员通过基因组筛选发现AsKslB，其与KslB序列同源性高（68% identity, 82% similarity）。体外酶活实验证实AsKslB能催化L-Trp与α-KG缩合生成KA，并确定其最适反应条件为HEPES缓冲液pH 7.6，温度26°C，且无需任何辅因子或金属离子。时间进程实验表明反应在2小时内基本完成。底物范围评估显示AsKslB对L-Trp吲哚环上的多种取代基（如F、Cl、Me、MeO）以及多种α-酮酸（如2-酮丁酸、2-酮己酸、草酰乙酸、α-KG、2-氧代己二酸、琥珀酸半醛、乙醛酸）具有宽泛的耐受性，但不能利用D-Trp、色胺等类似物，表明L-立体构型和羧基对底物识别至关重要。产物KA通过NMR和旋光度比对得以鉴定。

3.2. AsKslB的整体结构

AsKslB的晶体结构显示其为同源二聚体，每个单体由N端结构域（7个α螺旋）和C端结构域（10个反平行β链形成的β桶状结构）组成。底物结合口袋位于单体-单体界面处。与KslB和McbB的结构比对显示高度相似性。

3.3. 底物L-Trp的识别与结合机制

L-Trp结合结构显示，其羧基与Met²²⁵、Val²²⁶、Ser²²⁷的主链酰胺氮形成氢键，氨基与催化残基Glu²⁷⁶侧链相互作用。吲哚环被Arg⁶¹和Thr²⁶³夹持，并被相邻单体的Phe⁵⁵、Ile⁵⁹、Phe⁹⁸形成的疏水网络稳定。突变实验证实了这些残基的重要性。

3.4. 亚胺离子中间体IM-1结合的结构洞察

本研究最关键发现是成功捕获了IM-1中间体的高分辨率（1.7 ?）结构。IM-1的α-KG部分羧基与Arg²⁵⁸、Thr²⁶³、Lys²⁶⁶形成氢键网络。L-Trp部分的羧基保持类似结合模式。尤为重要的是，结构中发现一个水分子被捕获在Glu²⁷⁶侧链和IM-1的N原子之间，该水分子很可能是脱水步骤的产物。Glu276L突变导致酶活完全丧失，验证了Glu²⁷⁶的关键作用。

3.5. 最终产物KA的结合结构

KA结合结构显示，其羧基部分结合模式与IM-1相似，但吲哚环发生了约90°旋转，与Phe⁹⁸形成平行堆积。Thr²⁶³等残基继续提供疏水相互作用。

3.6. AsKslB在催化循环中的结构动力学

比较四种状态的结构发现，催化残基Glu²⁷⁶发生了显著的构象变化，以适应底物结合、中间体稳定和产物形成过程中的不同需求。从L-Trp到IM-1，吲哚环旋转约12°；从IM-1到KA，吲哚环进一步旋转约90°形成THβC环，而α-KG部分保持相对固定。

3.7. 与KslB、STR和NCS的结构比较

AsKslB与KslB结构高度保守，活性位点残基构象几乎相同，支持共享的催化机制。与植物来源的STR和NCS相比，AsKslB在序列和结构上均无同源性，属于不同的蛋白质家族，其底物识别策略是化学逻辑上的趋同进化。

3.8. AsKslB的位点定向突变

基于结构和序列比对，构建了13个突变体。F55A、F98A、V226A、Y232A、R258A、E276L等突变导致酶活完全丧失，表明这些残基对底物结合或催化至关重要。I59A、M225A、T263A、K266A突变显著降低酶活，而R61A和S227A突变保留部分活性，阐明了活性位点残基的功能层次。

3.9. 提出的机制

基于结构证据，提出了AsKslB催化的PSR机制：Glu²⁷⁶作为广义碱，促使L-Trp的氨基去质子化，进而亲核攻击α-KG的羰基碳，形成羧醇胺中间体，随后脱水生成IM-1。捕获的IM-1结构明确支持吲哚C2位对亚胺的si-面进行亲核攻击。随后，吲哚C2=C3双键对亚胺进行6-endo-trig环化，形成THβC环，Glu²⁷⁶可能进一步协助C2质子的脱除，生成最终产物KA。IM-1结构的解析为si-面选择性提供了直接的立体化学证据。

本研究通过对新型Pictet-Spenglerase AsKslB的系统性生化与结构生物学研究，首次直接观测并解析了PSR中关键的亚胺离子中间体IM-1的原子结构，揭示了其催化L-Trp与α-KG立体选择性缩合生成KA的完整分子路径。研究明确了活性口袋中关键残基（如Phe⁵⁵、Ile⁵⁹、Phe⁹⁸、Arg²⁵⁸、Thr²⁶³、Lys²⁶⁶，特别是经历构象变化的催化残基Glu²⁷⁶）在底物识别、中间体稳定和立体化学控制中的核心作用。所提出的催化机制，尤其是基于IM-1真实结构确定的si-面攻击途径，为理解PSase的催化奥秘提供了前所未有的直接结构证据。这项工作不仅深化了对PSR酶学机制的认识，展示了AsKslB作为立体选择性生物催化剂的巨大潜力，而且为未来基于结构的PSase理性工程改造以合成多样性的具有生物活性的N-杂环化合物奠定了坚实的理论基础。