谷氨酸棒杆菌膜蛋白Cgl2168及其Δ270G突变体通过调控能量代谢和应激适应增强耐热性的机制研究

《Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology》：Putative membrane protein Cgl2168 and its variant enhance thermotolerance in Corynebacterium glutamicum

本研究针对工业发酵中谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)高温耐受性差影响生产效率的瓶颈问题，通过比较基因组学鉴定出关键膜蛋白基因cgl2168及其Δ270G突变体。研究发现该突变通过延伸C端α-螺旋结构，协调氧化磷酸化(atpABCDEFGH)、硝酸盐代谢(narIJHK)和中心碳代谢等多条通路，显著提升菌株在40°C下的生长能力。该工作为构建高温耐受型工业微生物底盘提供了新靶点和理论依据。

　　

在工业生物制造领域，微生物细胞工厂常常需要在非最适温度条件下进行发酵生产。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为氨基酸工业生产的经典底盘菌，其最适生长温度为30°C，但在工业发酵过程中常需面临高达40°C的环境压力。高温会引发细胞膜流动性改变、蛋白质变性、代谢网络失调等一系列连锁反应，严重制约生产效率。因此，解析微生物耐热机制并构建高温耐受型菌株，成为工业生物技术领域的重要研究方向。

发表于《Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology》的最新研究，通过比较两个实验室保存的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株(13032-JN和13032-TJ)在高温度下的生长差异，发现了一个关键耐热性决定因子——推测膜蛋白Cgl2168及其变异体。研究人员发现13032-JN菌株在40°C下表现出显著增强的生长能力，其比生长速率达到0.73 h^-1，而13032-TJ菌株仅为0.3 h^-1，生物量相差2.43倍。

为阐明这一现象背后的分子机制，研究团队采用了一系列关键技术方法：通过全基因组测序和比较基因组分析鉴定菌株间差异突变位点；利用同源重组技术构建基因回补和敲除菌株；采用AlphaFold3进行蛋白质结构预测；通过RNA-seq转录组学分析全局基因表达变化；结合生物信息学工具进行KEGG通路富集分析和蛋白质互作网络预测。

3.1. 两个ATCC 13032实验室保存菌株耐热性差异的基因组学见解

研究人员通过全基因组比较分析，在13032-JN菌株中鉴定出23个单核苷酸多态性(SNP)和两个结构变异，包括cgl2612基因中的1403bp插入和31.4kb的原噬菌体基因缺失。通过逐个回复突变实验，证实cgl2168基因第270位鸟嘌呤缺失(cgl2168^Δ270G)是导致13032-JN菌株耐热性增强的关键因素。将13032-TJ菌株的cgl2168基因引入G270缺失突变后，其40°C下的生长能力显著提升，OD₆₀₀值提高了1.41倍。

3.2. Cgl2168和Cgl2168^Δ270G结构与功能的初步分析

基因功能验证表明，敲除cgl2168会严重损害菌株在40°C下的生长，而过表达cgl2168或其突变体均能恢复耐热性。结构分析显示，G270缺失导致移码突变，使蛋白质C端延伸出一个额外的α-螺旋结构(残基I114-F126)。基因组上下文分析发现，cgl2168与分枝杆菌Rv2169c和链霉菌Sco2097同源，这些蛋白均与细胞壁合成相关。STRING数据库预测Cgl2169可能与呼吸链复合物III核心亚基(QcrC/QcrA1)、应激响应蛋白等9个蛋白存在相互作用，提示其可能通过协调能量代谢和应激适应来增强耐热性。

3.3. Cgl2168突变体的转录组分析揭示耐热性调控网络

转录组分析显示，与回补菌株JN-2168R相比，13032-JN菌株(cgl2168^Δ270G)有88个基因显著上调，54个基因下调；而敲除菌株JN-Δcgl2168则有70个基因上调和23个基因下调。KEGG富集分析表明，氧化磷酸化、硝酸盐代谢和肌醇代谢通路显著富集。具体而言，cgl2168^Δ270G突变体中线粒体ATP合酶基因(atpABCDEFGH)、硝酸盐还原酶基因(narIJHK)以及细胞色素bd氧化酶组装蛋白基因(cydCD)均显著上调。同时，中心碳代谢关键基因如柠檬酸合酶(gltA)和丙酮酸羧化酶(pyc)表达增强，而糖异生相关基因磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)和发酵基因乳酸脱氢酶(ldh)表达下降。在JN-Δcgl2168菌株中，硫代谢相关基因(ssuBCD、cys和met操纵子)显著上调，可能是一种补偿性应激反应。

研究结论与讨论部分指出，Cgl2168及其变异体通过多层面调控增强谷氨酸棒杆菌的耐热性。在能量代谢方面，突变体通过增强ATP合成和电子传递链活性，为高温下的细胞活动提供充足能量；在碳代谢方面，优化中心代谢通量分配，提高碳源利用效率；在应激适应方面，调控热休克蛋白(如dnaK、groES)和氧化应激响应基因表达，维护细胞内环境稳态。特别值得注意的是，细胞色素bd氧化酶系统(cydCD)的上调可能帮助菌株适应高温导致的低氧环境，而硝酸盐代谢通路(narIJHK)的激活则为替代性能量供应提供了可能。

该研究不仅发现了一个新的耐热性关键调控因子，还系统解析了其作用机制，为理性设计高温耐受型工业微生物底盘提供了重要理论依据和工程靶点。未来通过整合多组学数据和合成生物学策略，有望进一步优化菌株性能，提升工业发酵效率。