综述：免疫分析或伪免疫分析在临床治疗药物监测中的应用

《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Immunoassays or pseudo-immunoassay for clinical therapeutic drug monitoring applications

本综述系统探讨了免疫分析（包括抗体、噬菌体展示肽、适配体、分子印迹聚合物等识别元件）与伪免疫分析技术在治疗药物监测（TDM）中的创新与进展。文章从识别元件、信号示踪剂（如天然酶、纳米酶、荧光分子示踪剂）和检测靶点（抗生素、抗肿瘤坏死因子药物、抗癫痫药、免疫抑制剂）三大核心组件出发，总结了技术突破，并结合分析科学家和临床药师的视角，讨论了当前挑战与未来前景，为开发新一代TDM试剂盒提供了思路。

　　

引言

传统的“一刀切”处方模式在临床实践中常导致治疗效果不佳。不同患者即使诊断相似，其生理和病理状态的差异也会导致所用药物的药代动力学和药效学特征、分布容积及清除率发生改变。基于治疗药物监测（TDM）的精准医疗通过优化药物治疗方案、提高药效、降低毒副作用及促进合理用药，显著改善了治疗效果。国际TDM与临床毒理学协会将TDM定义为实验室对某项参数的测量，该参数经适当解读后，将直接影响处方行为。通常，测量对象是生物基质中处方外源性化合物的浓度，但也可能是作为替代疗法给予生理性或病理性缺乏该化合物的患者的內源性化合物。实施TDM的标准是那些治疗窗窄、剂量与浓度关系高度可变和/或不可预测，以及过量或不足会导致严重临床后果的药物。

临床应用中，用于TDM的分析方法包括各类免疫分析、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）、气相色谱法和电泳法等。色谱法虽具有通用性强、灵敏、稳健、准确等显著优势，但其周转时间长、成本高，限制了在临床中的广泛应用，而基于免疫分析的方法被认为是克服这些局限的替代方案。基于免疫分析的即时检测（POCT）显著缩短了当前TDM方法从采样到出结果的时间滞后。

本综述从分析科学家和临床药师的双重视角，对免疫分析或伪免疫分析（伪免疫分析指免疫分析中的抗体被其他识别元件如噬菌体展示肽、适配体等替代的方法）进行了概述。由于临床对商业化免疫分析TDM的需求远超过现有选择，本文从免疫分析的三个基本组成部分——识别元件、信号示踪剂和检测靶点，总结了不同仿生系统的技术创新与进展。同时，分析科学家总是倾向于提高其免疫分析方法的检测限（LOD）等技术性能，这为近期提出的新型三级TDM模型中的靶点水平和下游水平TDM提供了技术支持的可能性。最后，我们从医院临床药师的角度讨论了挑战和未来展望，为分析科学家探索未来TDM应用的潜在领域提供思路。

技术创新与进展

免疫分析是一种基于抗原-抗体特异性结合反应的检测技术。免疫分析的三个基本组成部分包括检测靶点、识别元件和信号示踪剂。治疗性药物分子的检测靶点包括小靶点分子（STM），如用于器官移植的他克莫司，和大靶点分子（LTM），如用于免疫介导的炎症性疾病（IMIDs）的抗肿瘤坏死因子（TNF）药物英夫利昔单抗。

识别元件

抗体

迄今为止，全球抗体市场规模庞大，涉及多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体三种常见类型。由于固有缺点如交叉免疫导致对靶点特异性较低，多克隆抗体逐渐被单克隆抗体和工程化抗体所取代。抗体结构包含两个独立的模块：抗原结合片段（Fab）域和可结晶片段（Fc）区。Fab或Fv片段负责通过轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）的结合功能进行靶点识别。随着DNA重组技术的发展，一些更小的工程化抗体片段，如Fabs、单链Fv（scFv）、单域骆驼免疫球蛋白（也称为vHHs或纳米抗体）和双特异性抗体被设计出来，以扩展诊断应用。从分析特性来看，骆驼纳米抗体具有更高的稳定性，能抵抗蛋白酶、化学变性剂、极端pH或离子强度。同时，scFvs具有操作更灵活、背景非特异性结合更低的优点，但稳定性较纳米抗体差。纳米抗体和scFvs已成功用作识别元件，开发用于临床样本的灵敏、可丢弃的免疫分析。

噬菌体展示肽

噬菌体展示肽是通过噬菌体展示技术从噬菌体库中筛选鉴定得到的。由于对噬菌体展示技术的贡献，Smith和Winter共同获得了2018年诺贝尔化学奖。噬菌体展示技术被认为能够筛选出上述具有高亲和力和特异性的工程化抗体或肽。与抗体相比，肽由于分子尺寸小，具有更强的组织穿透能力。噬菌体展示肽广泛应用于药物递送系统、疾病特异性抗原模拟物筛选、细胞或器官特异性肽筛选以及生物医学分析。在免疫分析方面，一个名为ACEGLYAHWC、带有二硫键约束环的噬菌体展示肽被筛选出来，用于模拟免疫抑制剂霉酚酸（MPA）的效果。该肽能特异性识别MPA的重组抗体Fab片段，这为筛选间接作用于Fab而非靶分子本身的肽提供了一个有趣的思路。

适配体

作为“化学抗体”，适配体是通过指数富集的配体系统进化技术筛选出的单链寡核苷酸，主要在免疫分析中发挥分子识别功能。适配体可通过核酸序列的构象可塑性和三维折叠，以高特异性和亲和力结合STM或LTM。与抗体相比，适配体具有独特优势，如相对易于化学修饰、无病毒或细菌污染、批次间稳定性好、免疫原性低、可快速失活，以及易于与其他基于核酸的系统集成。适配体的应用趋势可分为三类：超过95%的应用属于分析研究，包括科学工具、临床试剂和环境传感器；信息学；生物物理学发现。在临床应用的分析研究方面，开发了一种基于适配体的微针电化学生物传感器，用于构建万古霉素和庆大霉素的微创实时TDM。

分子印迹聚合物

分子印迹技术是指在分子水平上通过模板化，使聚合物链的功能基团形成明确的空间排列。作为“抗体模拟物”，分子印迹聚合物（MIPs）是通过在感兴趣的模板“抗原”或其衍生物周围共聚功能单体和交联单体制备而成。通常，在适当溶剂中，模板与功能单体通过非共价或共价相互作用形成的复合物与交联单体共聚后，随后从三维聚合物网络中移除模板分子，产生与模板互补的印迹空腔，这些空腔在形状、大小和化学基团定位上与模板对应。MIPs显示出选择性识别靶点、制备相对容易、物理化学稳定性好、成本低、可重复使用、对更苛刻条件（如有机溶剂或极端pH环境）具有强耐受性等有前景的优点。

其他识别元件

通常，针对靶点的筛选过程需要结构稳定性，例如抗体制备和噬菌体展示肽筛选。作为重要的抗感染抗生素，β-内酰胺类抗生素在水溶液中易于水解。传统的筛选方法不适用于β-内酰胺类抗生素。因此，极有必要寻找能够靶向β-内酰胺类抗生素的识别元件，特别是对于重症监护室（ICU）的患者。由于β-内酰胺类抗生素通过作用于青霉素结合蛋白（PBPs）来抑制细菌肽聚糖的合成，因此PBPs被认为是β-内酰胺类抗生素的潜在候选识别元件。

信号示踪剂

商业化免疫分析试剂盒的信号示踪剂

由于能够批量处理临床样本和周转时间短的优势，商业化免疫分析试剂盒（CIKs）在临床实验室的TDM中得到广泛应用。由于ELISA和侧向流动免疫分析（LFIA）形式在商业品种中占主导地位，基于酶放大免疫分析技术（EMIT?）的CIKs尤为常见，特别是在常规TDM中用以取代繁琐的色谱方法。

天然酶

天然酶广泛用作免疫分析中的信号示踪剂。常见的天然酶包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（ALP）、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等。在天然酶中，来自辣根根的HRP和来自小牛肠的ALP是ELISA和其他免疫分析中最常用的两种。近年来，为了克服天然酶对恶劣环境条件极度敏感的缺点，金属有机框架（MOFs）被探索作为天然酶的载体，用于酶固定化，称为酶@MOFs。

纳米酶

纳米酶是基于纳米材料的人工酶。由于其良好的催化性能和对恶劣条件的增强耐受性，纳米酶吸引了分析科学家将其作为信号示踪剂替代天然酶，应用于生物传感领域和免疫分析。“纳米酶”一词由Scrimin及其同事在2004年创造，并将三氮杂环壬烷功能化的金纳米颗粒用作转磷酸化反应的催化剂。之后，Yan XY及其同事报道了磁性纳米颗粒（Fe₃O₄）显示出固有的类过氧化物酶活性，此后纳米酶成为免疫分析研究中最活跃的热点领域。

荧光分子示踪剂

由于在激发时能重复发光的特性，荧光示踪剂通常用于免疫分析，可提供极高的灵敏度。在实践中，大多数报道的荧光示踪剂包含一个芳香环作为发光基团，例如荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、香豆素衍生物、硼-二吡咯亚甲基衍生物、芘衍生物和萘衍生物。荧光分子示踪剂具有灵敏度高、非放射性、环境污染小、易于自动化等优点，使其在免疫分析中得到广泛应用。

检测靶点

抗生素

抗生素耐药性（AMR）是全球人类健康的主要危机，需要全球性的解决方案。每年预计约有500万死亡病例与细菌AMR相关。及时和优化的抗生素治疗与脓毒症患者较低的死亡率相关。TDM通过个体化抗生素给药方案，随着抗生素浓度与临床结果之间联系的证据日益增多，显示出显著益处。传统上，治疗窗窄的抗生素如万古霉素和氨基糖苷类被推荐进行TDM，但最近其他治疗窗宽的抗生素也需要进行TDM。

抗TNF药物

抗TNF药物包括阿达木单抗、英夫利昔单抗、赛妥珠单抗、乌司奴单抗和维多珠单抗，是治疗免疫介导的炎症性疾病（IMIDs）如类风湿性关节炎和炎症性肠病最有效的药物。然而，接受抗TNF药物治疗的IMID患者临床反应差异很大。因此，推荐进行TDM以优化抗TNF药物治疗。与其他小分子靶点（STM）不同，酶联免疫吸附试验（ELISA）是临床实践中最常用的方法。

抗癫痫药物

TDM在癫痫患者的临床管理中广泛应用于抗癫痫药物（AEDs）。这主要可归结为以下原因：血浆AEDs浓度比剂量能更好地关联临床效果；预防性AEDs剂量不足可能无法控制癫痫 breakthrough 发作；AEDs过量会导致最常见的中枢神经系统不良反应的疑似毒性，从而加剧癫痫发作。如表1所列，有许多获批的AEDs用于常规TDM。

免疫抑制剂

OPTN/SRTR 2023年度数据报告宣布，2023年美国有超过15万名实体器官移植候选者。免疫抑制剂（ISDs）的使用显著提高了实体器官同种异体移植患者的生存率，尽管根据基础合并症和移植类型，临床结果差异很大。对于实体器官同种异体移植患者，控制ISDs的剂量以应对移植物排斥和移植物抗宿主病非常困难且至关重要，因为剂量错误可能导致严重有时甚至是致命的后果。

总结与未来展望

低检测限方法的意义

当分析科学家开发新型免疫分析时，他们总是追求良好的分析性能，如低检测限（LOD）和宽动态范围。然而，一方面，用于评估实际样品适用性的基质往往不符合TDM的日常需求。另一方面，治疗药物的靶浓度范围通常处于ng/mL或μg/mL水平。从临床实践的角度来看，超低的LOD意义不大，这对分析科学家的实际价值提出了挑战。一个可行的解决方案是分析呼出气中的浓度。

复杂基质中的抗干扰问题

TDM应用的抗干扰问题涉及两个因素：识别元件和信号示踪剂。适配体这种识别元件在复杂基质（如血清）中会引起一些问题，原因是筛选过程与应用环境之间的缓冲条件（如离子强度、pH）和温度存在差异。适配体通常从单一缓冲液中筛选出来，导致其性能对该缓冲液高度特异。适配体的核酸结构也对二价或单价阳离子的组成和强度敏感。适配体总是在某一给定温度下进化，应用场景的不同温度可能会影响其亲和力和选择性。当试图将适配体应用于临床TDM时，更重要的是关注那些目前尚未获得其抗体的治疗药物。

对于信号示踪剂的抗干扰问题，当纳米酶打算应用于常规TDM时，应更加关注形成的蛋白质冠。当纳米酶与血液样本基质接触时，多种蛋白质会吸附在纳米酶表面，形成蛋白质冠。样本生物基质的条件和纳米颗粒（NPs）的性质都会影响NPs表面动态结合的蛋白质冠。蛋白质冠包括硬冠和软冠。硬冠会导致纳米酶示踪剂聚集并完全丧失活性，而软冠则会抑制纳米酶的功能。

识别元件与纳米酶之间的泄漏问题

识别元件和示踪剂的固定化策略显著影响TDM免疫分析的分析性能。合理设计的固定化可以确保检测的稳定性和准确性，这在临床实践中比灵敏度更为重要。通常，识别元件和示踪剂之间的固定化模式主要涉及两类：生物共轭和物理吸附。

为重症监护室患者开发TDM方法

在重症监护室（ICU）中，感染相关死亡率是一个重大的医疗问题。危及生命的ICU患者需要专业的重症监护，包括药物治疗护理，但药物剂量受到药代动力学改变、分布容积改变、药物清除率改变和药效学改变等异常生理状况的挑战。临床指南推荐对ICU患者进行常规TDM，包括β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类、利奈唑胺、替考拉宁、伏立康唑和万古霉素。ICU患者TDM的四个基本原则中的两个包括：定义相关的采样时间点；准确、及时的TDM方法。因此，建立用于连续检测ICU患者抗生素浓度的TDM方法至关重要。尽管微透析已被推荐并用于ICU患者的抗生素TDM，但分析科学家仍面临重要障碍，需要为这种情况开发常规的TDM生物传感器。