综述：基于CRISPR的单核苷酸变异检测诊断技术的最新进展

《Toxicon: X》：Recent Advances in CRISPR-Based Diagnostics for Single-Nucleotide Variant Detection

本综述系统探讨了CRISPR-Cas系统在单核苷酸变异（SNV）检测中的前沿进展。作者详细分析了从预切割靶标富集（Pre-Cleavage）、切割中突变判别（In-Cleavage）到切割后信号放大（Post-Cleavage）的三阶段策略，强调了其在癌症基因分型、病毒变异监测、抗菌素耐药性分析和遗传病诊断中的临床应用潜力，并指出其在无扩增、多重检测及临床标准化方向面临的挑战与机遇。

　　

Overview of CRISPR Technology

CRISPR-Cas系统最初于1980年代末在大肠杆菌（Escherichia coli）中被发现，是细菌和古菌中一种适应性免疫机制，用于防御外来遗传元件（如噬菌体和质粒）的入侵。该系统通过将外源DNA片段整合到宿主基因组中作为间隔序列（spacers），转录生成crRNA并引导Cas蛋白切割匹配序列。基于这一可编程切割机制，CRISPR-Cas技术——尤其是CRISPR-Cas9——已被广泛应用于基因组编辑领域。

Applications of CRISPR-based SNV Detection in Different Diseases

单核苷酸变异（SNV）作为最常见的遗传变异形式，与多种疾病的发病机制、进展和临床异质性密切相关。在癌症领域，体细胞SNV（如KRAS或TP53基因突变）是恶性肿瘤转化和治疗耐药性的关键驱动因素；在传染性疾病中，病毒基因组中的SNV（如SARS-CoV-2刺突蛋白D614G突变）可增强病毒感染力并促进免疫逃逸；细菌SNV（如Helicobacter pylori的23S rRNA基因突变）则可能导致抗生素耐药性；而在遗传病方面，单碱基改变（如HBB基因Glu6Val突变）可能引发严重疾病如镰状细胞贫血。

CRISPR-SNV检测平台凭借单碱基分辨率、高可编程性以及对多种样本类型的兼容性，在上述疾病的早期诊断、风险评估和治疗决策中展现出重要价值。例如，基于CRISPR-Cas12/13的检测系统通过其附带切割（collateral cleavage）活性，可在识别靶标后非特异性切割报告分子，实现荧光、电化学或比色等多种信号输出方式的放大，显著提高了检测的灵敏度和特异性。

Conclusion and perspectives

尽管CRISPR-SNV检测技术具有显著优势，但仍面临一些技术挑战，例如在复杂临床样本中对低频率突变（低VAF，Variant Allele Frequency）的检测能力、多重检测通量的限制以及标准化和自动化体系的缺乏。未来的研究方向可能包括开发PAM（Protospacer Adjacent Motif）非依赖型Cas变体、优化引导RNA（gRNA）设计以提高错配 discriminability，并整合新型信号读出技术（如基于石墨烯场效应晶体管gFET的电化学传感、DNAzyme级联反应等），以进一步提升检测灵敏度、缩短检测时间并拓展其临床应用场景。

此外，推进CRISPR诊断技术向无扩增（amplification-free）、多重靶标检测（multiplexing）和临床标准化方向迈进，将是实现其在床旁检测（Point-of-Care Testing, POCT）和资源有限地区应用的关键。