携带衣原体噬菌体φCPG1蛋白IN5和RGD肽的M13噬菌体构建及其抑制沙眼衣原体胞内生长的作用与机制研究

《Virology》：M13 phages engineered with chlamydia phage φCPG1 protein IN5 and arginine-glycine-aspartic acid inhibits Chlamydia trachomatis intracellular growth

本研究针对沙眼衣原体(C. t)抗生素耐药性日益严峻的临床挑战，构建了表达衣原体噬菌体φCPG1蛋白IN5（pIII）和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽RGD（pⅧⅧ）的重组M13噬菌体M13-RGD8-IN53。研究发现该工程噬菌体能有效进入宿主细胞及包涵体，显著抑制C. t增殖（抑制率达69.79%），其机制与下调多个毒力相关基因（如CT_456/Tarp、CT_666/Cdsf等）表达、干扰病原体发育周期中晚期阶段密切相关，为抗耐药C. t感染提供了新型治疗策略。

　　

在全球范围内，沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, C. t）是引起细菌性性传播泌尿生殖道感染最常见的病原体。根据世界卫生组织2024年发布的数据，2020年全球15至49岁成年人中新增C. t感染病例估计高达1.285亿例。这种专性细胞内寄生菌具有独特的双相生活周期，包括复制型的网状体（Reticulate Body, RB）和感染型的原体（Elementary Body, EB），其发育周期约48小时，分为早期（0-12小时）、中期（12-24小时）和晚期（24-48小时）。C. t感染可能导致女性宫颈炎、男性尿道炎，持续性无症状感染还与盆腔炎、不孕症和异位妊娠等严重后遗症相关。

近年来，由于红霉素、多西环素等抗生素的广泛使用，C. t的抗生素耐药性问题日益突出，临床治疗失败案例不断增加。即使更换治疗方案或采用联合治疗，治疗失败仍然存在，表明C. t可能通过耐药基因突变产生了抗生素耐药性。然而，针对C. t的疫苗研发进展缓慢，因此开发具有新机制的治疗方法迫在眉睫。

在这种背景下，噬菌体疗法作为一种潜在替代方案引起了研究人员的关注。虽然已有六种噬菌体（Chp1、Chp2、Chp3、Chp4、φCPG1和φCPAR39）从衣原体科细菌中分离出来，但尚未从C. t中成功分离出特异性噬菌体。其中，φCPG1是一种特异性感染豚鼠自然寄生虫——豚鼠衣原体（Chlamydia caviae）的烈性噬菌体。先前研究表明，φCPG1的衣壳蛋白Vp1可通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路抑制C. t生长，而Vp1表面的插入环5（IN5）区域在宿主识别中起关键作用，其单独表达对C. t生长的抑制率可达54.50%。

然而，由于C. t是专性细胞内寄生菌，Vp1或IN5与其潜在受体——C. t的多态性膜蛋白I（Polymorphic Membrane Protein I, PmpI）之间的相互作用在病原体进入宿主细胞后会减弱。此外，IN5抑制C. t侵袭的具体机制尚未明确。为解决这些问题，研究人员将目光投向了M13噬菌体——一种已获美国FDA批准应用、对哺乳动物细胞无害的温和噬菌体。M13噬菌体可作为基因递送载体，容纳超过2700种肽段，其衣壳蛋白pⅧⅧ和pIII允许外源肽或蛋白的展示。其中，整合素结合肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arginine-Glycine-Aspartic Acid, RGD）能诱导整合素介导的内吞作用，提高M13噬菌体的细胞附着能力。

基于以上背景，天津医科大学总医院皮肤性病科游聪、王梅、王江义、连婷婷和刘全忠研究团队在《Virology》上发表了一项创新性研究，他们构建了一种携带IN5蛋白和RGD肽的双功能重组M13噬菌体，并系统评估了其对C. t感染的抑制效果及作用机制。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：通过分子克隆构建展示RGD肽（pⅧⅧ）和IN5蛋白（pIII）的重组M13噬菌体；采用蛋白质印迹法（Western blotting）验证IN5蛋白表达；通过噬斑测定法进行噬菌体定量；利用共聚焦激光扫描显微镜观察噬菌体在HeLa细胞和C. t包涵体中的分布；借助免疫荧光显微镜和定量PCR（qPCR）分析工程化噬菌体对C. t感染的影响及毒力相关基因的表达变化。

3.1. M13噬菌体的基因工程改造

研究人员通过DNA片段扩增和融合，成功构建了能在外壳表面展示所需融合蛋白或肽的重组M13噬菌体。其中，pⅧⅧ上的RGD肽（称为M13-RGD₈和M13-RGD₈-IN5₃）旨在增强噬菌体被HeLa细胞的内吞作用，而pIII上的C. caviae噬菌体蛋白IN5（称为M13-IN5₃和M13-RGD₈-IN5₃）则用于抑制C. t生长。

3.2. IN5蛋白表达确认和重组噬菌体定量

蛋白质印迹分析证实了IN5/pIII融合蛋白的成功表达。通过噬斑测定，M13、M13-RGD₈、M13-IN5₃和M13-RGD₈-IN5₃噬菌体的滴度分别为1.6×10¹⁴ pfu/mL、6.1×10¹⁴ pfu/mL、3.3×10¹⁴ pfu/mL和1.4×10¹⁴ pfu/mL。

3.3. M13-IN5₃和M13-RGD₈-IN5₃对C. t增殖的种类和剂量依赖性效应及对HeLa细胞的细胞毒性

研究发现在10⁶至10⁹ pfu/mL的浓度范围内，M13-IN5₃和M13-RGD₈-IN5₃噬菌体均能抑制C. t增殖，且这种抑制效应呈剂量依赖性。在10⁹ pfu/mL浓度下，M13-RGD₈-IN5₃组的抑制效果（69.79%）显著优于M13-IN5₃组（48.09%）。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验表明，在≤10⁹ pfu/mL的浓度下，重组噬菌体对HeLa细胞无细胞毒性作用。

3.4. 噬菌体定位验证

共聚焦激光扫描显微镜观察显示，M13、M13-RGD₈、M13-RGD₈-IN5₃和M13-IN5₃噬菌体均能进入并聚集在HeLa细胞核周围。其中，只有M13-RGD₈-IN5₃和M13-IN5₃能转运到包涵体腔内。与M13和M13-IN5₃噬菌体相比，HeLa细胞中存在更多的M13-RGD₈和M13-RGD₈-IN5₃噬菌体。此外，包涵体腔内的M13-RGD₈-IN5₃数量也多于M13-IN5₃。这表明RGD增强了噬菌体被C. t和HeLa细胞的摄取，而IN5则增强了在包涵体中的定位。

3.5. M13-IN5₃和M13-RGD₈-IN5₃对C. t感染的发育阶段依赖性效应

通过免疫荧光显微镜和qPCR评估噬菌体在C. t发育周期不同阶段的影响，研究人员发现噬菌体感染在早期时间点（直至感染后12小时）对C. t荧光强度无显著影响。而在感染后24、36和48小时（C. t生命周期的中期和晚期），噬菌体组的C. t生长受到抑制，表现为包涵体数量和荧光强度显著下降。M13-RGD₈-IN5₃噬菌体的抑制效果显著高于M13-IN5₃组。噬菌体滴度定量证实，在整个C. t发育周期中，噬菌体均存在于HeLa细胞内。

qPCR分析显示，与无噬菌体组相比，M13-IN5₃和M13-RGD₈-IN5₃处理组中多个C. t毒力相关基因的表达发生显著变化。在感染后48小时，CT_046（HctB）、CT_443（OmcB）、CT_444（OmcA）、CT_456（Tarp）、CT_666（Cdsf）、CT_694（TmeA）、CT_743（HctA）和CT_875（TepP）的表达均下调，而唯一上调的基因是CT_119（IncA）。在M13-RGD₈-IN5₃处理组中，所有下调基因的转录水平在感染后36和48小时均低于M13-IN5₃组。

本研究成功构建了表达衣原体噬菌体φCPG1蛋白IN5的重组M13-RGD₈-IN5₃噬菌体，并证实该噬菌体能进入HeLa细胞和包涵体，有效抑制C. t生长。研究表明，M13-RGD₈-IN5₃噬菌体在减轻C. t感染方面优于M13-IN5₃噬菌体，这主要归因于RGD基序增强了噬菌体的细胞渗透性。重组噬菌体引起了下调C. t感染性相关基因（如CT_046/HctB、CT_443/OmcB、CT_444/OmcA、CT_456/Tarp、CT_666/Cdsf、CT_694/TmeA、CT_743/HctA和CT_875/TepP）的表达，同时上调了CT_119/IncA基因。这些基因表达变化主要影响C. t发育周期的中晚期阶段，导致成熟EBs的形成减少、毒力减弱。

该研究的重要意义在于为应对日益严峻的C. t抗生素耐药性问题提供了一种全新的治疗策略。通过基因工程改造M13噬菌体，使其携带具有抗菌活性的噬菌体蛋白（IN5）和细胞穿透增强肽（RGD），创造了一种能够靶向细胞内病原体的新型治疗工具。这不仅为C. t感染的治疗提供了新思路，也为其他细胞内病原体的治疗研究提供了可借鉴的技术路线。研究中对C. t毒力基因表达变化的系统分析，深化了对噬菌体抗C. t作用分子机制的理解，为后续优化治疗策略奠定了理论基础。然而，本研究仍处于体外实验阶段，未来需要进一步开展体内研究，评估其在复杂生理环境中的安全性和有效性，并探索其与现有抗生素的协同作用潜力。