果蝇癌模型中组织架构与细胞粘附调控集体细胞分层方向性的机制研究

《iScience》：The directionality of collective cell delamination is governed by tissue architecture and cell adhesion in a Drosophila carcinoma model

本研究针对上皮性肿瘤细胞脱离组织时的方向性调控机制这一关键科学问题，通过构建果蝇RasV12癌模型，结合遗传操作与计算模拟，揭示了Septate junctions（SJ）完整性缺失在协同RasV12表达时驱动集体细胞分层的作用。研究发现，SJ功能丧失在正常上皮细胞中诱发凋亡，而在RasV12突变细胞中则促进其存活与分层，且分层方向（顶端或基底侧）由组织架构（鳞状/假复层上皮）及细胞间特异性粘附模式共同决定。通过建立二维智能体模型，进一步验证了组织固有特性（如细胞排列方式）与突变细胞间及其与野生型细胞的优先粘附是调控分层方向的核心因素。该研究为理解肿瘤细胞侵袭的初始步骤提供了新的理论框架，并提示SJ成分在癌症发生中具有非闭塞性功能。

　　

上皮组织是构成器官的重要结构，细胞通过紧密连接形成机械化学屏障。当上皮细胞发生癌变时，它们会脱离原始组织，这种脱离的方向性直接影响肿瘤的恶性程度。然而，细胞连接如何参与这一过程，以及细胞脱离的方向性如何被调控，至今仍不清楚。在脊椎动物中，组织监视机制通常通过顶端挤出清除有害细胞，而在无脊椎动物中则多通过基底挤出。但当细胞凋亡被阻断时，如致癌基因Ras（Ras^V12）发生突变，细胞脱离的方向可能发生逆转，从而增加恶性肿瘤的风险。尽管一些分子调控因子开始被揭示，但细胞脱离方向的调控机制以及在此过程中细胞连接的重塑仍知之甚少。

为了解答这些问题，研究人员利用果蝇这一模式生物，以其幼虫眼-触角成虫盘为研究对象。该组织包含鳞状的周皮上皮（PE）和假复层的盘本部（DP），两者通过顶端域相对，中间由腔隙分隔。这种独特的结构为研究不同上皮架构中细胞行为提供了理想模型。研究团队通过MARCM技术生成特定基因突变细胞克隆，重点关注了Septate junctions（SJ）——一种在无脊椎动物中起旁细胞扩散屏障作用的连接结构——其核心组分（如Coracle, Nervana 2, Anakonda, Gliotactin, M6）的功能。此前已知M6缺失与Ras^V12协同可驱动肿瘤进展，但这是否是M6特有的功能，还是SJ完整性普遍丧失的结果，尚不明确。

本研究主要运用了果蝇遗传学技术（如MARCM克隆分析）、免疫荧光染色（标记E-cadherin, β-integrin, 细胞极性蛋白、细胞凋亡标志物等）、共聚焦显微镜成像进行形态学与细胞生物学分析，并开发了二维智能体模型进行计算模拟，以量化组织架构、细胞粘附等参数对细胞分层方向的影响。

Loss of septate junction integrity promotes cell death and extrusion

研究人员发现，无论是双细胞连接（如nrv2）还是三细胞连接（如aka, M6）的核心组分发生功能缺失突变，都会在上皮细胞中引发细胞核固缩和Caspase-1活化，导致细胞凋亡并被挤出上皮层，且不引起明显的组织变形。这表明SJ对于维持上皮细胞的存活至关重要。

Loss of septate junction components in conjunction with Ras^V12 promotes collective delamination

当在SJ突变细胞中同时表达Ras^V12（可阻断凋亡）时，细胞不再死亡，而是发生集体性脱离。无论是M6、aka还是nrv2的缺失，与Ras^V12协同均能诱导脱离现象。重要的是，脱离的方式和细胞连接重塑因位置而异：在鳞状上皮中，细胞簇集体向顶端（腔隙内）脱离，E-cadherin沿细胞侧膜分布；在假复层上皮中，细胞则向基底侧脱离，形成放射状排列的“玫瑰花结”结构，E-cadherin局限于中心区域。

Septate junction-depleted Ras^V12 clones delaminate basally and form rosettes containing differentiated cells

通过细胞分化标志物Elav的研究，团队确认基底侧脱离形成的玫瑰花结来源于形态发生沟（MF）后方的已分化细胞区域。这些细胞在脱离后仍能保持顶端的细胞极性（如aPKC定位）。而在MF前方的未分化区域，SJ-/--Ras^V12克隆则表现为顶端收缩和组织折叠，伴有E-cadherin和极性的基底侧去局部化。

Septate junction-depleted Ras^V12 clones delaminate apically from the squamous epithelium

对鳞状上皮中顶端脱离过程的详细时相分析揭示了一个多步骤过程：细胞克隆首先发生顶端收缩，呈圆顶状（“章鱼”阶段），发出腔隙突起，此时E-cadherin和β-integrin在侧膜富集，磷酸化肌球蛋白轻链（P-Myo）在克隆边界和突起尖端激活；随后细胞集体向腔隙内移位并最终脱离。整个过程不伴随Caspase活化，表明是独立于凋亡的主动过程。α-连环蛋白（α-catenin）在突变细胞之间及其与野生型细胞交界处富集，提示特异性粘附的存在。

Events of epithelia destabilization in silico recapitulate in vivo outcomes

为了量化调控因素，研究团队建立了二维智能体模型，模拟了三种关键事件：顶端收缩（ApC）、顶端细胞-细胞粘附丧失（A）、基底细胞-基质粘附丧失（B）。模拟结果显示，在假复层上皮中，无论事件发生顺序如何，基底脱离都是主要结局，体现了该组织架构对基底方向性的内在偏向性。克隆大小的影响较小，但模拟中出现了克隆分裂（同一克隆细胞向两侧脱离）的现象，这在体内未见。

The architecture of the pseudostratified epithelium favors the basal directionality

进一步模拟发现，引入事件Ai（仅去除克隆细胞与野生型细胞间的顶端粘附，而保留克隆细胞间的粘附）只能轻微降低顶端脱离率，但不能完全阻止克隆分裂。而当强化克隆细胞间的侧向粘附后，克隆分裂被抑制，基底脱离成为绝对主导。即使模拟增加基底基质的阻力（非允许性环境）阻止了实际的基底脱离，细胞核仍倾向于基底侧定位，再次证明了假复层上皮架构对基底方向性的内在决定作用。

The squamous epithelium is highly sensitive to junctional remodeling and preferential adhesion

与之相反，在鳞状上皮中，模拟结果显示其对参数变化更为敏感。克隆增大增加了基底脱离倾向，但实施Ai事件（破坏克隆与邻居的粘附）能彻底逆转方向性，使顶端脱离成为主流。强化克隆细胞间侧向粘附若未伴随Ai事件，则不足以逆转方向。更重要的是，模拟一个具有物理屏障作用的基底基质（非允许性环境）完全阻断了基底脱离的可能性，迫使所有场景均走向顶端脱离。这提示体内鳞状上皮下方的细胞外基质可能通过物理限制作用，偏向于顶端脱离。体内实验观察到α-catenin在顶端脱离的“颈部”区域富集，以及β-integrin在脱离细胞中的持续存在，支持了计算模型中“特异性粘附”是调控鳞状上皮中顶端集体脱离关键因素的预测。

结论与意义

本研究通过整合果蝇遗传学模型与计算生物学模拟，系统地阐明了细胞连接、特别是SJ，在调控上皮细胞稳态和肿瘤细胞脱离方向性中的核心作用。研究发现，SJ完整性丧失本身足以触发上皮细胞凋亡，这是一种重要的组织监视机制。而当与致癌信号Ras^V12协同时，SJ功能的破坏则促进了活细胞的集体脱离，其方向性并非随机，而是由组织本身的架构（鳞状或假复层）以及细胞间粘附的特性共同精确调控。计算模型揭示了组织固有特性是方向性的首要决定因素，而细胞粘附的特异性修饰则 fine-tune 了这一过程，尤其在架构约束较弱的鳞状上皮中作用关键。这项工作不仅揭示了SJ在癌症发生中此前未被重视的非闭塞性功能（即维持细胞存活与调控组织形态），而且为理解肿瘤细胞侵袭起始步骤的力学和分子基础提供了新的范式，强调了组织微环境在决定肿瘤细胞行为中的重要性。相关发现对于理解人类癌症中紧密连接（TJ）成分（与SJ同源）频繁突变的意义具有重要启示。