炭疽水肿毒素通过激活Rac1和RTK信号通路诱导F-肌动蛋白重组和内皮通透性的机制研究

《iScience》：Anthrax ET activates Rac1 and RTK signaling to induce F-actin reorganization and endothelial permeability

本研究针对炭疽毒素引起的血管屏障功能障碍这一临床难题，揭示了水肿毒素(ET)通过cAMP依赖的Rac1/cofilin轴和cAMP非依赖的IGF1R/EGFR转激活双重机制破坏内皮细胞F-肌动蛋白骨架的新途径。研究人员发现Rac1、PI3K和MEK抑制剂能显著缓解小鼠足垫水肿模型中的毒素效应，为晚期炭疽毒素血症的治疗提供了新的靶向策略。

　　

当炭疽杆菌这一古老而致命的病原体侵入人体时，它释放的毒素如同特洛伊木马般悄无声息地瓦解着我们的防御系统。特别是在感染晚期，即使抗生素能够清除细菌，患者仍可能因毒素引发的血管崩溃而死亡。这背后的元凶之一——水肿毒素(Edema Toxin, ET)，以其强大的腺苷酸环化酶活性著称，却能绕过常规治疗手段，直接攻击血管内皮细胞这一重要屏障。

在《iScience》最新发表的研究中，Prashant Jain和Annabel Guichard领衔的研究团队揭开了ET破坏血管屏障的新机制。以往我们已知ET通过干扰细胞连接蛋白的运输来削弱内皮连接，但这项研究发现了更为根本的破坏方式——直接瓦解细胞的骨架系统。

研究人员采用了一系列先进的技术方法：利用人脑微血管内皮细胞(HBMEC)模型进行体外机制研究，通过蛋白质印迹(Western blot)和GTP酶活性检测分析信号通路激活，采用高内涵筛选技术定量细胞形态变化，使用Transwell渗透性 assay评估内皮屏障功能，并建立小鼠足垫水肿模型进行体内药效验证。

ET诱导皮质肌动蛋白重排

研究人员首先观察到ET处理4小时后，人脑微血管内皮细胞(HBMEC)出现了显著的F-肌动蛋白网络破坏。通过Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽染色发现，ET以剂量依赖的方式导致皮质肌动蛋白和应力纤维的丢失，同时诱发F-肌动蛋白簇状聚集和板状伪足形成。有趣的是，催化失活的ET突变体(ETmut)和单独的保护性抗原(PA)也能引起轻微的F-肌动蛋白重组，表明ET的作用既包含cAMP依赖的途径，也包含cAMP非依赖的组分。

水肿毒素激活Rac1信号破坏F-肌动蛋白组织

通过CellMask Green染料定量分析发现，ET处理使细胞面积减少了约2倍。进一步机制探究显示，ET显著增加了Rac1-GTP(活性Rac1)水平约3倍，而RhoA-GTP水平未增加甚至在高浓度毒素下降低。使用特异性Rac1抑制剂NSC23766能够有效挽救ET诱导的肌动蛋白重排和细胞面积减少，表明Rac1是介导这一过程的关键分子。

更重要的是，Rac1抑制剂还能逆转ET引起的单层渗透性增加。在Transwell实验中，ET处理24小时显著提高HBMEC单层渗透性，而NSC23766预处理则显著缓解这一效应。

水肿毒素诱导肌动蛋白切割蛋白cofilin(CFL1)的激活

研究发现ET通过Rac1依赖的方式激活了肌动蛋白切割蛋白cofilin。Western blot结果显示，ET处理4小时后，磷酸化cofilin(pCFL1)在Ser-3位点的水平显著降低，表明cofilin被激活。这一过程需要cAMP的产生，因为ETmut或PA单独处理均不能诱导cofilin去磷酸化。

研究人员还发现ET通过Rac1依赖的方式激活了cofilin磷酸酶Slingshot(SSH1)。SSH1在Ser-978位点的磷酸化水平在ET处理后降低，表明SSH1被激活。NSC23766能够抑制ET诱导的SSH1去磷酸化，证实了Rac1在这一过程中的关键作用。

Rac1活性有助于水肿毒素抑制exocyst依赖性运输

此前研究发现ET通过干扰exocyst介导的连接蛋白运输来破坏细胞连接。本研究中，研究人员发现Rac1抑制剂能够挽救ET对Sec15-GFP聚集体的抑制作用，表明Rac1至少部分介导了ET对exocyst组装的抑制。

这些发现表明，CFL1去磷酸化、SSH1激活和exocyst组装抑制都发生在ET诱导的Rac1激活下游，共同导致肌动蛋白重组、细胞表面减少和单层渗透性增加。

水肿毒素以cAMP非依赖方式激活酪氨酸激酶受体IGF1R和EGFR

令人惊讶的是，研究发现ET能在10分钟内诱导IGF1R在Tyr-1135/1136位点的酪氨酸磷酸化，且这一效应不依赖于cAMP的产生，因为ETmut和PA单独处理也能激活IGF1R。IGF1R抑制剂AG1024几乎完全阻断了ET对Rac1激活、细胞面积减少和F-肌动蛋白重排的影响。

类似地，ET也能快速激活EGFR及其下游ERK信号。EGFR抑制剂AG1478和MEK抑制剂AS-703026都能有效缓解ET诱导的细胞骨架缺陷。机制研究表明，ET通过Src激酶和基质金属蛋白酶(MMP)介导的配体脱落两种途径激活EGFR。

PI3K、MEK和Rac1功能的药理学抑制保护 against 水肿毒素诱导的水肿 in vivo

最后，研究在小鼠足垫水肿模型中验证了这些信号通路成分的治疗潜力。预处理的PI3K抑制剂GDC-0941和MEK抑制剂AS-703026，以及共同给药的Rac1抑制剂NSC23766，都能显著减轻ET诱导的水肿。其中PI3K和Rac1抑制剂的保护效果最强，与中和抗体治疗相当，且保护效果可持续至18小时。

这项研究系统阐明了炭疽水肿毒素破坏内皮屏障的双重机制：早期通过cAMP非依赖的RTK信号转激活，后期通过cAMP依赖的Rac1/cofilin轴激活。这些发现不仅深化了对炭疽病理机制的理解，更重要的是鉴定出了一系列可靶向的信号节点，为晚期炭疽毒素血症的治疗提供了新的策略。考虑到抗生素耐药性的日益严重，这种针对宿主细胞信号通路的辅助治疗策略具有重要的临床转化价值。

研究的局限性在于尚未在炭疽杆菌感染模型中验证这些抑制剂的保护效果，且LT毒素可能通过抑制MAPK信号而产生复杂相互作用。未来研究需要进一步评估这些化合物在完整感染模型中的疗效和安全性。