利用蛋白质反式剪接技术实现多特异性抗体的模块化生成与高通量筛选

《mAbs》：Modular generation of multispecific antibodies using protein trans-splicing

本文系统介绍了利用内含肽（intein）介导的蛋白质反式剪接技术构建多特异性抗体的创新平台。该技术通过模块化组装策略高效生成双特异性（bispecific）和三特异性（trispecific）抗体，经实验验证其理化性质和功能活性与传统方法制备的抗体高度一致。研究为快速筛选最优抗体组合和分子形式提供了新方案，显著加速了多特异性抗体药物的开发进程。

　　

引言

多特异性抗体已成为生物制药领域具有广阔治疗前景的重要品类。与传统单克隆抗体不同，多特异性抗体能同时结合多个表位，从而增强靶向特异性、扩大疾病覆盖范围，并提供免疫细胞重定向、靶向蛋白降解和半衰期延长等新作用机制。自2014年首个双特异性抗体获批以来，该领域发展迅猛，目前有超过560种多特异性抗体处于临床试验阶段，千余种处于临床前开发。

抗体工程技术的成熟推动了多特异性抗体领域的发展。虽然将单链结合域串联成单一多肽链是直接策略，但治疗开发主要聚焦于类IgG（Immunoglobulin G）格式。这些构建体保留了可结晶片段（Fc）域，能利用新生儿Fc受体（FcRn）介导的回收延长血清半衰期，利用抗体效应功能作为作用机制，并受益于成熟的单克隆抗体（mAb）生产和开发基础设施。

多特异性抗体治疗开发的关键挑战在于其庞大设计空间。多个靶点的众多可能结合体组合带来了重大制造难题，而多种分子几何结构的加入更加剧了这一组合挑战。应对此挑战需要从模块化构建块创建多特异性抗体库，以简化并加速生产流程。目前已有多种高效筛选策略，通常采用分子重排或化学酶法。例如，受控Fab臂交换利用Fc中的突变促进重链解离和交换，使双特异性抗体在后续氧化后重组。此外，二硫键重桥接和Spytag、Sortase等酶也通过酶促连接用于生成双特异性抗体。

分裂内含肽（split intein）因其特异性、温和反应条件及连接侧翼多肽时对天然蛋白序列改变最小等特点，为多特异性抗体的模块化生成提供了极具吸引力的解决方案。例如，生产单价双特异性IgG需要将融合N-内含肽片段（Int^N）的Fab与一个IgG异源二聚体（其中一条臂含有Fab，另一条臂融合C-内含肽片段（Int^C）组合。该过程已用于生产单价双特异性IgG，并证明与可实现后续高通量筛选的自动化技术兼容。该技术进一步扩展到具有近乎无疤痕剪接通点的单价双特异性抗体以及二价双特异性抗体。

结果

分子设计与命名

本研究使用工程化增强蛋白质反式剪接活性、表达和对外显子依赖稳健性的Cfa_GEP分裂内含肽。首先创建了四种不同的Fab，其C末端与Cfa N-内含肽融合（Fab-Int^N），分别结合靶抗原HER2、EGFR和cMET上的不同表位。同时构建了10个IgG“支架”库（Int^C-scaffolds），包含人IgG1的Fc、一个或多个Fab，以及在一个或两个重链N末端附加的Cfa C-内含肽。

通过将4个Fab-Int^N和10个Int^C-scaffold构建块组合，可生成40种不同的多特异性抗体。本研究生产了16种代表性多特异性抗体，涵盖多种格式，包括单价双特异性（1 + 1）、单价三特异性（1 + 1 + 1）、二/单价双特异性（2 + 1）、二价双特异性（2 + 2）和二/单价三特异性（2 + 1 + 1）。此外，还使用DuetMab平台生成了一组单价双特异性抗体作为基准，以验证蛋白质剪接生成分子的保真度。

蛋白质剪接产生的单价双特异性抗体具有与DuetMab对应物相似的理化功能特性

为验证蛋白质剪接技术的可行性，将含有αCD3 Fab的Int^C-scaffold（1）与αEGFR Fab-Int^N（a）反应，生成单价双特异性IgG1抗体（1a）。还原SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis）分析显示预期分子量条带，去除内含肽起始材料，且条带分布与基准1A相似。分析性SEC（Size Exclusion Chromatography）表明1a保留时间比反应物短，与蛋白质剪接导致的尺寸增加一致，且与DuetMab类似物保留时间相同。质谱分析进一步证实预期剪接产物。

生物层干涉术（Biolayer Interferometry, BLI）抗原结合评估显示，1a和1A对可溶性EGFR和CD3的结合相似。后续动力学分析表明，1a对CD3结合的K_D值在基准1A的25%以内，对EGFR结合在5%以内。为评估结果重现性，生成了另外五种单价双特异性IgG，结合EGFR、HER2、CD3和cMET表位的独特组合（1b、1c、1d、2a和2c）。通过SDS-PAGE、SEC和BLI比较剪接分子与相应DuetMab基准，证实每种情况下抗体的理化特性均得到忠实再现。

随后评估了剪接双特异性抗体在细胞实验中重现常规抗体功能特性的能力。流式细胞术检测显示，所有剪接分子与相应DuetMab基准对非小细胞肺癌系NCI-H358的EGFR、HER2和cMET结合近乎相同。评估四种双特异性T细胞衔接器（T-cell engager, TCE）的CD3结合时，剪接分子与基准对HPB-ALL细胞的结合相似。所有测得的NCI-H358细胞结合EC₅₀值均在DuetMab类似物的1.5倍以内。

在细胞毒性实验中，αHER2-αEGFR双特异性2a和双特异性αHER2 2c抗体均显示出与基准相当的细胞毒性，αHER2-αEGFR双特异性比αHER2双特异性活性更强。抗体2a和2c还通过抗体-药物偶联物（Antibody-Drug Conjugate, ADC） assay进行评估，其中与auristatin载荷偶联的αFc Fab与测试物品复合以诱导内化依赖性细胞毒性。结果显示近乎完全的细胞溶解，更敏感地证实了剪接分子与相应DuetMab对照的活性相似。由于分子1a–d均含有肿瘤相关抗原和CD3结合部分，在TCE细胞毒性 assay中评估了其活性。剪接TCE的EC₅₀值在DuetMab基准的1.5倍以内。CD25⁺和CD69⁺阳性CD4⁺和CD8⁺ T细胞的量化显示剪接双特异性抗体与DuetMab基准之间的激活等效。这些结果共同证明剪接双特异性抗体准确复制了常规生产DuetMab抗体的理化和功能特性。

通过蛋白质剪接生成单价三特异性抗体

受剪接单价双特异性IgG的理化功能特性忠实地重现常规生产分子的鼓舞，进一步探索分裂内含肽的工程潜力，将该技术与临床验证的DuetMab平台整合，以生成更复杂的多特异性抗体。首先创建了DuetMab Int^C-scaffolds，可与Fab-Int^N反应生成单价三特异性抗体。Int^C-scaffolds 4和5是αEGFR-αCD3双特异性抗体，其C-内含肽结构域分别融合到αCD3或αEGFR Fab的重链N末端。这些Int^C-scaffolds与αHER2 Fab-Int^N b反应产生4b和5b，两种具有不同几何取向的单价三特异性TCE抗体。

还原SDS-PAGE分析这些反应，鉴定出比任一前体分子量更大的条带，大小与预期75 kDa剪接产物一致。分析性SEC显示4b和5b比双特异性1A保留时间更早，表明剪接三特异性抗体完整尺寸增加。BLI抗原结合评估表明，剪接三特异性抗体4b和5b与相应对照双特异性DuetMab对可溶性EGFR、HER2和CD3的结合相似。

进一步确定两种剪接三特异性抗体的不同几何取向是否会导致细胞结合或TCE assay细胞毒性的功能差异。虽然对EGFR⁺/HER2⁺ NCI-H358细胞的结合在两种取向下保持相似，但4b对CD3⁺ HPB-ALL的结合较5b弱，尽管通过BLI测量对可溶性CD3抗原的结合相似。这种差异与αCD3 Fab直接与另一个Fab融合时在细胞表面展示的CD3抗原接合中存在空间阻碍一致，这在其他TCE形式中也有观察到。4b减弱的细胞CD3结合与其在TCE细胞毒性 assay中相对于5b的较低效力相关。与单价对应物1a和1b相比，4b和5b三特异性均显示出增强的EC₅₀值，与其二价靶细胞接合一致。这些结果共同证明内含肽技术可与DuetMab平台无缝结合以生成三特异性抗体。

通过双重剪接构建二价多特异性抗体

此前描述了在Int^C-scaffold上使用单个蛋白质剪接事件生成多特异性抗体。设想在含有两个Int^C融合的支架上进行两个剪接反应可实现更复杂多特异性抗体格式的组装。为探索此可能性，生成了三种不同的双Int^C支架：用于生产2 + 2双特异性抗体的同二聚mAb样支架、用于生产2 + 1双特异性抗体的单价支架，以及用于生产2 + 1 + 1三特异性抗体的双特异性支架。

Int^C-scaffolds 8和9与αHER2 Fab-Int^N b组合产生2 + 2 αHER2-αEGFR（8b）和2 + 1 + 1 αHER2-αEGFR-αCD3（9b）三特异性抗体，而Int^C-scaffold 3与αEGFR Fab-Int^N a组合产生2 + 1 αHER2-αEGFR（3a）双特异性抗体。还原SDS-PAGE和分析性SEC均证实存在与预期剪接产物一致的高分子量物种。质谱分析证实存在预期剪接重链。这些分析还鉴定了通过双重剪接制作的格式中存在残留未剪接重链，归因于水解的C-内含肽。由于未剪接分子会导致较低亲和力，通过BLI评估了抗原结合。具有单价抗原结合的剪接分子（3a和9b的CD3，9b的EGFR）显示出与相应DuetMab基准相似的结合动力学。相比之下，具有二价抗原结合的剪接分子（8b和3a的EGFR，8b和9b的HER2）表现出比单价DuetMab基准更慢的抗原解离，与双重剪接反应增加的亲和力一致。在残留未剪接分子可能显著改变功能读数的 scenario中，这些杂质可通过额外精纯步骤（即离子交换色谱）去除。

为进一步探索双重剪接产生复杂多特异性抗体的潜力，生成了额外的双特异性2 + 1（3b和3c）、三特异性2 + 1 + 1（10a）和双特异性2 + 2（6c和7b）抗体。所有剪接多特异性抗体均与NCI-H358细胞结合，其中靶向EGFR的结合更强。鉴于该细胞系的测量亲和力和报告受体密度相当，将观察到的差异归因于所选EGFR结合子在细胞环境中表现出增强的靶点接合。αHER2双特异性2 + 2分子（6c和7b）和αHER2–αEGFR 2 + 2分子（8a）在直接杀伤和ADC assay中进行了评估。其中，8a表现出更强效力，与NCI-H358细胞结合结果一致。该队列中的TCE，分子3a–c、9b和10a，均显示对HPB-ALL细胞的结合减弱，与先前观察到的空间受阻CD3结合Fab一致。在TCE assay中，3a表现出比3b和3c高6倍以上的活性，与观察到的增强靶细胞接合一致。有趣的是，10a表现出比9b高11倍的活性，尽管对靶细胞和CD3⁺ HPB-ALL细胞的细胞结合相当。这可能表明10a的靶点接合几何结构更有利于免疫突触形成。在CD4⁺和CD8⁺细胞中观察到T细胞激活的类似模式。这些结果共同证明双重剪接可用于生成复杂的二价双特异性和三特异性抗体。

讨论

双特异性抗体治疗近年来显著成熟，多种分子获批并在肿瘤学和其他疾病领域展示重要临床影响。随着对这些形式的信心增长和抗体工程改进可制造性的持续进步，该领域已超越双特异性抗体，探索更复杂的形式，包括三特异性和甚至四特异性抗体。随着这些形式持续演进和成熟，对促进快速生成和筛选具有所需生物活性的双特异性和多特异性抗体的工具需求日益增长。为保持相关性和有效性，此类工具必须具有固有灵活性，能够容纳下一代多特异性抗体治疗不断扩大的多样性和结构复杂性。

本研究展示了使用内含肽介导的蛋白质反式剪接生成多特异性抗体的模块化平台。通过组合一小组Fab-Int^N和Int^C-scaffold前体，成功生成了具有广泛价数和特异性的多样化多特异性抗体面板。在手提纯内含肽构建块后，成功应用该技术通过一小时剪接反应生成多特异性抗体，随后进行约三天的额外处理，包括再氧化和缓冲液交换。这项工作将分裂内含肽的效用从简单Fab-IgG融合构建体扩展到可编程多特异性抗体组装的通用策略，精确控制结合几何结构和复杂性。重要的是，证明了剪接单价双特异性IgG分子忠实地重现了通过常规方法生成的双特异性抗体的生化、生物物理和功能特性。

随后将该方法扩展至通过将内含肽结构域整合到现有双特异性DuetMab支架中生产单价三特异性抗体。所得三特异性分子显示出与相应对照分子相当的靶点结合特性。有趣的是，三特异性在CD3结合和T细胞衔接器效力上存在差异，突出了分子几何结构对功能活性的影响，特别是当CD3结合Fab置于另一个Fab相邻时的空间阻碍效应。此类效应在其他TCE形式中也有观察到，并强调了空间配置在多特异性设计中的重要性。

为进一步证明内含肽平台的 versatility，在单一抗体支架上进行了双重蛋白质剪接反应以生成二价多特异性抗体。这使得能够创建更复杂的格式，如2 + 2、2 + 1和2 + 1 + 1架构，这些格式使用传统高通量表达方法难以高均一性生产。具有二价结合结构域的抗体显示出增强的靶点接合和更慢的抗原解离动力学，与亲和力效应一致。值得注意的是，抗原接合的几何结构和价数直接影响细胞毒性效力，表明抗原结合结构域的空间排列可能影响免疫突触形成和下游信号效率。

这些发现共同确立了内含肽介导的剪接作为组合生成和功能筛选多特异性抗体的强大工具，包括单价双特异性（1 + 1）、单价三特异性（1 + 1 + 1）、二/单价双特异性（2 + 1）、二价双特异性（2 + 2）和二/单价三特异性（2 + 1 + 1）格式。将结合子生产与最终分子组装解耦的能力允许跨不同几何格式快速迭代，随着多特异性抗体设计趋向更复杂和先进治疗作用机制，这一能力日益宝贵。内含肽剪接非常适合高通量筛选应用，其中多特异性架构的快速原型制作可加速发现阶段项目的先导优化。确实，该方法能够生成大型组合库，其多样性相对于抗体构建块数量呈指数级扩展，使其特别适用于筛选广阔的多特异性设计空间。虽然本工作聚焦于IgG格式和基于Fab的结合子，但该技术原则上可用于整合其他治疗部分，如单域抗体、细胞因子和 paratope 屏蔽结构域。总体而言，此处提出的基于内含肽的多特异性抗体组装平台为筛选下一代抗体治疗提供了可扩展、模块化和稳健的方法。