综述：肽天然产物生物合成中的氨基酸定制策略

《TRENDS IN Chemistry》：Amino acid tailoring strategies in peptide natural product biosynthesis

本综述聚焦于肽类天然产物生物合成中非经典氨基酸（ncAA）的多样化酶促定制策略，系统梳理了2021年至2025年中的最新研究进展。文章对比了核糖体合成并经翻译后修饰的肽（RiPP）和非核糖体肽（NRP）两大生物合成路线，揭示了通过前体代谢物修饰、非核糖体肽合成酶（NRPS）结合中间体修饰以及翻译后修饰等途径产生结构复杂ncAA的分子机制，并特别强调了不同生物合成系统间的趋同进化与跨界合作现象，为基于合成生物学和酶催化技术的创新药物研发提供了重要见解。

　　

肽天然产物以其卓越的结构多样性和广泛的生物活性而闻名。这种多样性很大程度上源于其非经典氨基酸（ncAA）构建单元，这些氨基酸通过专门的生物合成酶进行转化，从而产生对生物活性至关重要的化学功能团。自然界主要通过两种基本策略来合成这些修饰肽：核糖体途径和非核糖体途径。

生物合成前体的定制

在非核糖体肽（NRP）生物合成中，游离的α-L-氨基酸可以通过酶促修饰生成特定的ncAA，随后由非核糖体肽合成酶（NRPS）的腺苷化（A）结构域识别并掺入最终产物。例如，抗结核化合物紫霉素和卷曲霉素中的特征性组分(2S,3S)-卷丝孢菌啶（L-Cap）的生物合成，始于L-精氨酸（L-Arg）的立体选择性Cβ-羟基化，随后发生脱水及分子内共轭加成，形成六元环产物。另一个例子是3-呋喃丙氨酸（Fua），其生物合成起源于L-酪氨酸（L-Tyr），通过芳香族加氧酶RhzB催化羟基化和C-C键断裂等步骤形成呋喃环。环丙烷氨基酸如(1'R,2'S)-3-(2-氨基环丙基)丙氨酸（Acpa）和(1'R,2'R)-3-(2-硝基环丙基)丙氨酸（Ncpa）的形成，则涉及L-赖氨酸（L-Lys）的氧化和随后的环丙烷化反应。此外，还有从非氨基酸前体合成ncAA的例子，如肽抗生素Q6402A中的1-氨基-2-甲基环丙烷羧酸（Me-ACC）是由钴胺素依赖的自由基S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）甲基酶和吡哆醛-5'-磷酸（PLP）依赖的氨基环丙烷羧酸合酶共同催化生成的。

NRPS结合中间体的修饰反应

氨基酸修饰也可以在NRPS组装过程中，通过整合在组装线内的顺式作用结构域或反式作用的生物合成酶引入。近年来表征的含氮-氮（N-N）键的ncAA生物合成，如N-硝基甘氨酸（Nng）和重氮化合物氮丝氨酸（Aza）、噻扎林（Thz），揭示了其共享的早期生物合成步骤，仅在后期氧化和水解步骤出现分化。其途径始于L-Lys的N6-羟基化，随后与甘氨酸或苏氨酸偶联，再经C-N键断裂生成肼乙酸（HAA）中间体，该中间体经过修饰并加载到肽酰载体蛋白（PCP）上，最终与丝氨酸融合并氧化形成重氮或N-硝基等官能团。值得注意的是，(2S,3S)-卷丝孢菌啶的生物合成也存在一条与游离氨基酸途径不同的、基于硫模板机制的替代路线，这体现了趋同进化。在默尔霉素和凝乳酶抑制素生物合成中，酰基辅酶A脱氢酶家族成员Mur22（AnpI）以NRPS结合的L-Arg为底物，催化FAD依赖的脱氢反应形成α,β-不饱和硫酯，随后发生分子内共轭加成形成环状结构。此外，在杆菌噻唑的生物合成中，FMN依赖的氧化酶NrsB以反式作用方式，将多噻唑啉中间体迭代氧化为多噻唑，其催化机制与已知的RiPP脱氢酶相似，提示了NRPS和RiPP系统在酶进化上的潜在联系。

NRPS组装前后的修饰

β-羟基等官能团的引入可以在NRPS组装的不同阶段进行。一个不寻常的NRPS后修饰例子是 luzopeptin A 中罕见的酰基取代的ncAA四氢哒嗪-3-羧酸（Thp）的生物合成。其途径涉及由L-鸟氨酸（L-Orn）经N5-羟基-L-鸟氨酸（N⁵-OH-L-Orn）中间体生成哌嗪酸，后者被掺入NRPS机制。肽组装完成后，细胞色素P450酶Luz26催化一系列氧化转化，包括羟基化和一个不寻常的C-N键去饱和，最终形成带有腙结构的4-OH-Thp残基。随后，膜结合乙酰转移酶Luz27利用乙酰辅酶A对4-OH-Thp上的羟基进行逐步的O-乙酰化。

RiPP生物合成中的氨基酸修饰

核糖体合成并经翻译后修饰的肽（RiPPs）虽然最初仅限于20种蛋白源性氨基酸，但其通过广泛的翻译后修饰展现出与NRPs相媲美的结构复杂性。例如，具有强效抗革兰氏阳性菌活性的双酚霉素类大环肽，其生物合成涉及多核非血红素铁依赖的氧化酶PbsC与其含有RiPP识别元件的伴侣蛋白PbsD共同催化前体肽中保守FRF模序内的每个苯丙氨酸残基发生邻位羟基化，生成邻位酪氨酸（ortho-Tyr）；随后精氨酸酶PbsE将精氨酸（Arg）脱胍基化为鸟氨酸（Orn），再由杯状结构羟基酶PbsQ催化鸟氨酸羟基化，生成γ-羟基-L-鸟氨酸（γ-OH-L-Orn）。具有细胞毒活性的RiPP kintamdin则含有多个脱氢氨基酸，包括一个罕见的β-烯胺酸（Z）-3-氨基-丙烯酸（Aaa或Δ²βAla）。其形成涉及激酶KinD和磷酸苏氨酸裂合酶KinC的协同作用，通过一个推测的氮丙啶中间体开环生成。与NRPs类似，RiPPs中也发现了环丙烷氨基酸的合成途径。例如，rSAM酶TvgB能够在前体肽TvgA的重复TVGG模序中，在缬氨酸侧链的未活化甲基之间形成C-C键，生成环丙基甘氨酸（Cpg）残基。氨基丙二酸（Ama）的生物合成则通过一个双酶途径实现：铁（II）/2-氧代戊二酸依赖的加氧酶SmaO先羟基化天冬氨酸（Asp）的β-碳，随后非典型HD结构域酶SmaX通过氧化性Cβ-Cγ键断裂，有效移除一个亚甲基单元，生成Ama。

跨越生物合成界限：杂合肽生物合成途径

尽管NRPS和RiPP途径被认为是独立的，但近年来的研究发现了模糊这种界限的例子，表明这些途径或其基本原理可以被整合以产生复杂的肽天然产物。红霉素（rufomycins）的生物合成展示了RiPP和NRPS途径的前所未有的整合。这些强效抗结核depsi肽含有一个独特的3-硝基-L-酪氨酸残基。其生物合成涉及一个由基因簇编码的RiPP前体五肽MRYLH，其中的酪氨酸残基由细胞色素P450单加氧酶RufO直接硝化，该酶由一个C-C交联P450进化而来。修饰后，专用的肽酶RufB切除被硝化的酪氨酸，使其能够通过NRPS RufT掺入红霉素。阿拉佐肽汀（alazopeptin）是另一个有趣的例子，其生物合成需要两种不同的肽键形成系统：一个NRPS-like途径用于DON-DON的组装，一个ATP-grasp酶用于丙氨酸的掺入。此外，在氨酰胺类吡咯并咪唑醌天然产物的生物合成中，一类称为PEARLs（肽氨酰-tRNA连接酶）的独特酶，能够将氨基酸从氨酰-tRNA转移到核糖体合成的支架肽的C末端，随后经过黄素蛋白催化的羟基化和氧化重排，最终生成芳香胺。

自然界通过作用于不同底物（游离前体、载体蛋白结合中间体或核糖体合成肽）的专门催化剂，发明了多种途径来实现复杂氨基酸转化。不同生物合成路线可能产生相同产物，如卷丝孢菌啶，体现了趋同进化。此外，生物合成系统间意想不到的合作（如RiPP-NRPS杂合体、ATP-grasp连接酶介导的延伸或作用于支架肽的PEARLs）展示了自然界解决复杂生物合成问题的多功能性。这些新型催化剂在复杂药物分子的高效化学酶法合成或用于定制生产修饰设计肽的合成生物学平台构建方面显示出巨大潜力。随着基因组挖掘方法的不断发现，以及测序、生物信息学和合成生物学的进一步发展，预计将继续面临意想不到的生物合成新发现，并揭示更多隐藏的途径相互联系。人工智能和机器学习的最新发展如何改变和加速天然产物的发现、生物合成和工程化工作流程，将是未来令人兴奋的方向。