棕榈酰转移酶ZDHHC19通过介导组蛋白H3棕榈酰化调控小鼠精子形成过程中的组蛋白-鱼精蛋白交换

《SCIENCE ADVANCES》：Palmitoyltransferase ZDHHC19 regulates histone-to-protamine exchange during spermiogenesis in mice

本研究聚焦于精子形成（spermiogenesis）过程中组蛋白-鱼精蛋白（PRM）交换机制不清的难题，揭示了棕榈酰转移酶ZDHHC19通过催化组蛋白H3第110位半胱氨酸（C110）的棕榈酰化，减弱H3-H4相互作用，增加染色质可及性，从而促进组蛋白移除和鱼精蛋白掺入，最终保障染色质正常凝缩和雄性生育能力。该发现阐明了组蛋白棕榈酰化在染色质重塑中的新功能，为男性不育的机制研究提供了新视角。

　　

在生命诞生的奇妙旅程中，精子的正常发育是确保遗传信息准确传递的关键环节。哺乳动物的精子发生（spermatogenesis）是一个复杂而精密的过程，其最终阶段——精子形成（spermiogenesis）——尤为关键。在此阶段，圆形的精子细胞需要经历一系列剧烈的形态变化，包括顶体形成、鞭毛伸长、细胞质排除以及最为核心的染色质高度凝缩。这种极致的凝缩是通过组蛋白（histone）被鱼精蛋白（protamine, PRM）大规模替换来实现的，这一过程被称为组蛋白-鱼精蛋白交换（histone-to-protamine exchange）。大约90-95%的组蛋白会被移除，由富含精氨酸的鱼精蛋白接管DNA的包装任务，这不仅极大地压缩了基因组体积，也保护了DNA在精子漫长的旅程中免受损伤。然而，尽管这一过程至关重要，其精确的分子调控机制，特别是组蛋白是如何被“标记”以便被有效移除的，仍然是生殖生物学领域一个亟待解答的核心问题。

以往的研究表明，组蛋白的多种翻译后修饰（Posttranslational Modifications, PTMs），如乙酰化、泛素化等，通过削弱组蛋白与DNA的相互作用，为过渡蛋白（transition protein, TNP）和鱼精蛋白的接入创造了条件。一些关键蛋白，如CHD5、NUT、RNF8、PHF7等，被证实通过调控这些修饰参与了组蛋白的移除过程。然而，另一种重要的PTM——可逆的棕榈酰化（palmitoylation）——在精子形成中的作用却鲜为人知。棕榈酰化是由含有锌指DHHC结构域的蛋白质（Zinc-finger DHHC domain-containing protein, ZDHHC）家族催化的，它通过将长链脂肪酸（如棕榈酸）共价连接到蛋白质的半胱氨酸残基上，从而调节蛋白质的定位、稳定性和功能。虽然棕榈酰化在癌症、免疫和神经科学领域研究广泛，但其在生殖与发育中的潜在功能直到最近才引起关注。

为了探索棕榈酰化在雄性生殖中的奥秘，一项发表在《SCIENCE ADVANCES》上的研究将目光投向了一个特定的棕榈酰转移酶——ZDHHC19。研究人员发现，ZDHHC19在成年小鼠睾丸中特异性高表达，尤其是在单倍体精子细胞中。这提示ZDHHC19可能在精子形成的后期扮演着重要角色。那么，ZDHHC19究竟有何功能？它的缺失会对精子产生怎样的影响？其背后的分子机制又是什么？为了回答这些问题，研究团队展开了一系列深入细致的探究。

本研究综合运用了多种关键技术方法。研究人员首先通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了^Zdhhc19全身性敲除（Zdhhc19^?/?）、生殖细胞特异性敲除（Zdhhc19^SpKO）以及棕榈酰转移酶催化位点突变（Zdhhc19^C142S/C142S） knock-in 等多种基因修饰小鼠模型，以评估ZDHHC19在体内的功能。利用这些模型，研究团队通过计算机辅助精液分析（CASA）、扫描和透射电子显微镜（SEM/TEM）、精子染色质结构 assay（SCSA）、免疫荧光、免疫印迹（Western blot）、体外受精（IVF）和卵胞浆内单精子注射（ICSI）等技术，系统地表征了精子形态、活力、染色质凝缩度及受精能力。在机制探索层面，研究人员采用了点击化学（Click chemistry）结合质谱分析、酰基-树脂辅助捕获（acyl-RAC） assay、免疫共沉淀（co-IP）、染色质免疫共沉淀（ChIP）、CUT&Tag以及ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing）等高通量或高特异性技术，来鉴定ZDHHC19的底物，并阐明其如何通过修饰组蛋白来调控染色质结构和组蛋白交换过程。

Zdhhc19敲除损害精子发生

研究证实，Zdhhc19在睾丸中特异性高表达，尤其在单倍体精子细胞中。生殖细胞特异性敲除Zdhhc19会导致雄性小鼠完全不育，其精子出现典型的“头部基部弯曲”畸形，且精子活力和数量显著下降。重要的是，支持细胞（Sertoli cell）特异性敲除Zdhhc19并不影响雄性生育力，表明ZDHHC19的功能主要在生殖细胞中发挥。透射电镜显示Zdhhc19^?/?精子细胞核凝缩不全，密度不均，并出现空泡。这些结果表明，Zdhhc19缺失特异性地损害了精子形成过程中的染色质凝缩。

Zdhhc19缺失破坏组蛋白-PRM交换

对成熟精子的蛋白分析发现，Zdhhc19^?/?精子中核心组蛋白（H2A, H2B, H3）和过渡蛋白（TNP1, TNP2）的残留量显著增加，而鱼精蛋白（PRM1, PRM2）的分布出现异常，PRM1在细胞质和细胞核中均有分布，PRM2的前体（pre-PRM2）也异常滞留。免疫荧光结果进一步证实了组蛋白的滞留和鱼精蛋白的错误定位。这些发现明确指出，Zdhhc19的缺失严重破坏了组蛋白到鱼精蛋白的正常交换过程。

ZDHHC19的PAT活性对精子发生至关重要

为了探究ZDHHC19的酶活性是否是其功能所必需的，研究人员构建了催化中心关键半胱氨酸（C142）突变为丝氨酸（S）的 knock-in 小鼠（Zdhhc19^C142S/C142S）。该突变体小鼠睾丸中ZDHHC19蛋白的棕榈酰化水平大幅降低，证实其酶活性受损。与完全敲除表型类似但程度较轻，Zdhhc19^C142S/C142S雄性小鼠生育力显著下降，精子畸形率升高，并同样表现出组蛋白滞留和鱼精蛋白分布异常。这说明ZDHHC19的棕榈酰酰基转移酶（PAT）活性是其调控精子发生的关键。

ZDHHC19特异性催化组蛋白H3在半胱氨酸-110处的棕榈酰化

通过质谱分析和酰基-RAC assay，研究人员将组蛋白H3鉴定为ZDHHC19的关键底物。在Zdhhc19^?/?和Zdhhc19^C142S/C142S小鼠睾丸中，H3的棕榈酰化水平显著降低。细胞实验证实，过表达野生型ZDHHC19能显著提高内源性H3的棕榈酰化水平，而过表达酶活失活的ZDHHC19^C142S则无此效果。进一步的位点突变实验表明，ZDHHC19特异性催化H3在第110位半胱氨酸（C110）的棕榈酰化，而非其他位点（如C96）。

ZDHHC19介导的H3棕榈酰化减弱H3-H4相互作用

机制上，研究发现H3的棕榈酰化位点C110位于其球状结构域，靠近H3-H4四聚体界面。免疫共沉淀实验显示，在Zdhhc19^?/?和Zdhhc19^C142S/C142S小鼠的单倍体精子细胞中，H3与H4的结合强度显著高于野生型。同样，在细胞模型中，H3的C110S突变体与H4的结合也更强。这表明H3的棕榈酰化能够减弱H3与H4之间的相互作用。

ZDHHC19介导的H3棕榈酰化促进精子发生过程中的染色质重塑

减弱的核心组蛋白相互作用通常有利于染色质结构的松动。通过ChIP、CUT&Tag和ATAC-seq分析，研究人员发现，在Zdhhc19^?/?精子细胞中，H3与DNA的结合增加，全基因组范围内的染色质可及性（chromatin accessibility）降低。相反，在细胞中过表达野生型ZDHHC19则能增加染色质可及性。因此，ZDHHC19通过催化H3 C110位点的棕榈酰化， destabilizes 核小体结构，增加染色质的开放性，从而为组蛋白的移除和鱼精蛋白的掺入创造了有利条件。

综上所述，本研究揭示了棕榈酰转移酶ZDHHC19在精子形成中的一个前所未有的关键作用。它通过催化组蛋白H3第110位半胱氨酸的棕榈酰化，这一修饰直接削弱了核心组蛋白之间的相互作用，进而增加了染色质的可及性，最终促进了组蛋白-鱼精蛋白的高效交换和染色质的正常凝缩。当Zdhhc19缺失或其酶活性受损时，H3棕榈酰化水平下降，导致组蛋白滞留、鱼精蛋白掺入异常，引发染色质凝缩缺陷、精子头部畸形和雄性不育。

这项研究的发现具有多重重要意义。首先，它首次将蛋白质棕榈酰化这一重要的翻译后修饰与精子发生中最为关键的染色质重塑事件直接联系起来，极大地拓展了我们对生殖细胞特异性表观遗传调控机制的理解。其次，研究明确了ZDHHC19及其底物H3是调控雄性生育力的关键分子轴，为诊断和治疗由染色质凝缩障碍引起的男性不育症提供了新的潜在靶点和理论依据。此外，研究还提示组蛋白的棕榈酰化可能是一种普遍存在的调控核小体动态和染色质结构的机制，其作用可能不限于生殖细胞，对理解体细胞中的染色质生物学也具有启发意义。最后，研究所构建的多种基因修饰小鼠模型和所应用的多种前沿技术，为后续深入研究棕榈酰化在发育和疾病中的作用提供了宝贵的资源和策略。总之，这项工作照亮了精子形成领域中一个此前未知的调控维度，为生殖医学和表观遗传学的研究开辟了新的方向。