染色体外环状DNA通过cGAS-STING通路介导炎症反应促进肝细胞癌发生发展的机制研究

《SCIENCE ADVANCES》：Extrachromosomal circular DNA promotes inflammation and hepatocellular carcinoma development

本研究针对慢性肝病向肝癌转化过程中微核作用机制不明的难题，通过构建Mcl1Δhep小鼠模型，首次揭示微核来源的染色体外环状DNA(eccDNA)可通过激活cGAS-STING通路介导肝细胞与免疫细胞对话，驱动炎症相关性肝癌发生。该发现为肝癌防治提供了新的理论依据和潜在治疗靶点。

　　

肝细胞癌是全球范围内发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤，其中超过80%的病例发生在慢性肝病背景基础上。慢性肝脏炎症和纤维化伴随持续的肝细胞死亡，这一病理过程可逐步进展为肝硬化，并显著增加肝癌发生风险。尽管早在二十年前就有研究报道在人类慢性肝病和肝细胞癌组织中存在微核增多现象，但微核在肝癌发生发展中的具体作用机制至今仍未完全阐明。

为了深入探究这一科学问题，研究人员利用肝细胞特异性Mcl1基因敲除（Mcl1^Δhep）小鼠作为慢性肝病模型，开展了一系列创新性研究。该研究首次发现微核中富含的染色体外环状DNA(eccDNA)是连接肝细胞DNA损伤与免疫细胞激活的关键分子，并通过新开发的核分离DNA纤维(NuSeF) assay技术证实微核比主核更易发生复制应激。相关研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》杂志上。

研究团队主要采用了以下几种关键技术方法：通过肝细胞特异性基因敲除小鼠模型模拟人类慢性肝病进程；利用新开发的核分离DNA纤维(NuSeF) assay分析微核和主核内的复制动力学；采用环状DNA测序(cirSeq)技术全面鉴定eccDNA的特征；通过体外细胞共培养和体内动物模型验证eccDNA的免疫刺激功能；收集临床患者样本进行组织学分析和分子验证。

研究结果显示，Mcl1^Δhep小鼠肝脏显示微核水平增加和cGAS-STING通路激活。DNA纤维实验表明MCL1缺陷的肝细胞复制叉停滞率更高，提示复制应激增加。免疫荧光染色证实Mcl1^Δhep肝脏中微核化肝细胞显著增多，同时cGAS和STING表达在mRNA和蛋白水平均上调。

eccDNA在Mcl1^Δhep肝脏中增加并具有强免疫刺激活性。研究人员建立了从肝组织分离eccDNA的方法，发现Mcl1^Δhep肝脏含有更多eccDNA。电子显微镜可视化确认了eccDNA的存在。从Mcl1^Δhep肝脏分离的免疫细胞显示更强的STING表达和NF-κB活性。

CirSeq显示Mcl1^Δhep肝脏相比WT肝脏有更高量的eccDNA，来源于所有染色体。环状测序分析发现Mcl1^Δhep肝脏中eccDNA数量是WT的10倍以上，但平均长度显著缩短。eccDNA主要包含基因间序列或部分基因，全长基因携带率极低。

微核比主核含有更多eccDNA。通过流式细胞术分选微核和主核并进行cirSeq，发现微核中eccDNA水平显著高于主核。大多数eccDNA长度低于6000bp，且微核倾向于产生更小的eccDNA。

NuSeF assay揭示微核存在表现出更强复制应激的内在缺陷。新开发的核分离DNA纤维 assay显示微核的DNA纤维总长度显著短于主核，表明复制叉整体减慢。微核对camptothecin(CPT)处理更敏感，复制叉停滞事件更频繁。

eccDNA通过微核间接转移至BMDMs。实验表明，直接将eccDNA加入培养基或应用条件培养基均不能刺激BMDMs中Ifnb1表达，而用微核富集组分处理可显著诱导Ifnb1表达，提示微核可作为eccDNA递送至巨噬细胞的载体。

eccDNA在高肿瘤发生率的小鼠肝脏疾病模型中增加。比较不同小鼠模型发现，Mcl1^Δhep和Myc^OE小鼠eccDNA水平高且肿瘤发生率也高，而JNK1/2^Δhep和快餐饮食模型eccDNA水平低且肿瘤发生率低。

eccDNA水平在人类CLD和HCC组织中增加。临床样本分析显示，慢性肝病组织中eccDNA已增加，肝细胞癌组织中显著升高。eccDNA高水平组Ki67阳性细胞百分比显著高于低水平组，且与多种增殖相关基因表达呈正相关。

Sting1缺失减少Mcl1^Δhep小鼠的炎症和肿瘤发生率。Mcl1^Δhep Sting1^-/-小鼠显示免疫反应相关特征下调，巨噬细胞浸润减少，12月龄时肿瘤发生率从56.52%降至33.33%。

该研究结论部分指出，微核中eccDNA的积累在肝细胞与免疫细胞之间的对话中起连接作用，维持肝脏免疫反应。Mcl1^Δhep小鼠的癌变是通过非细胞自主机制介导的，肝细胞与免疫细胞之间的相互作用起着关键作用。NuSeF assay这一新方法能够研究微核中的复制叉动力学，从而发现微核中更高的复制应激。

这项研究的重要意义在于首次阐明了微核来源的eccDNA通过cGAS-STING通路促进慢性肝病向肝癌转化的分子机制，为理解炎症驱动性肝癌发生提供了新的理论框架。研究发现eccDNA具有强效免疫刺激活性，且其产生与复制应激密切相关，这为肝癌的早期诊断和防治提供了新的生物标志物和潜在治疗靶点。特别是针对cGAS-STING通路的干预策略，可能为预防慢性肝病进展为肝癌提供新的思路。