CEP76功能异常通过影响中心体-纤毛界面导致纤毛病谱系的机制研究

《SCIENCE ADVANCES》：CEP76 impairment at the centrosome-cilium interface contributes to a spectrum of ciliopathies

本研究针对纤毛病致病机制不清的问题，通过遗传学与功能实验相结合，发现CEP76基因双等位基因变异是导致包括神经发育异常、眼部缺陷等多系统纤毛病的新病因。研究人员证实CEP76缺失会破坏纤毛形成、过渡区结构及IFT88介导的顺向鞭毛内运输，并通过蛋白质组学揭示了CEP76与ALMS1、LUZP1等关键蛋白的相互作用，为理解中心体-纤毛生物学提供了新机制见解。

　　

在人类遗传疾病中，纤毛病（Ciliopathies）是一大类由于纤毛结构或功能缺陷导致的遗传性疾病。纤毛是突出于细胞表面的毛发状细胞器，作为细胞的“天线”，在感知细胞外信号、调控发育通路中发挥关键作用。由于纤毛几乎存在于所有脊椎动物的细胞类型中，其功能障碍可累及多个器官系统，包括大脑、眼睛、肾脏、骨骼等，导致一系列临床综合征，如Joubert综合征（JBTS）、Bardet-Biedl综合征（BBS）、Alstrom综合征（ALMS）等。迄今为止，已有超过180个基因被确认与纤毛病相关，其中140多个与原发性纤毛病（由感觉或非运动纤毛功能受损引起）有关。然而，仍有部分患者的遗传病因不明，且许多纤毛蛋白在纤毛外的功能（如细胞周期调控、细胞骨架维持等）也增加了疾病的临床异质性，使得致病机制的解析充满挑战。

中心体和纤毛在结构和功能上紧密相连。中心体是细胞的主要微管组织中心，在细胞分裂期参与形成纺锤体极，而在静止期，中心体的母中心体可转化为基体（Basal Body），作为纤毛的锚定和生长起点。因此，中心体-纤毛界面（centrosome-cilium interface）的完整性对纤毛的组装和功能至关重要。CEP76（Centrosomal Protein 76）是一种中心体蛋白，此前的研究表明它通过与其他中心体蛋白（如CCP110、CEP97）相互作用，在防止中心体过度复制（centriole reduplication）中发挥作用，但其在纤毛发生（ciliogenesis）和纤毛病中的具体角色尚不清楚。

为了探索纤毛病的新致病基因和机制，一个国际研究团队在《科学·进展》（SCIENCE ADVANCES）上发表了他们的最新研究成果。研究人员通过对大量纤毛病患者进行靶向测序和全外显子组/基因组测序（ES/GS），在8个无亲缘关系的个体中发现了CEP76基因的双等位基因变异（biallelic variants），这些患者表现出神经发育异常、眼部病变以及其他多系统特征。为了验证CEP76变异的功能影响，研究团队综合利用患者来源的成纤维细胞、基因敲除的细胞模型（如RPE1细胞）、斑马鱼（zebrafish）突变体以及体外互补实验（in vitro complementation assays）等多种技术平台，并结合蛋白质组学（proteomics）分析，深入探究了CEP76缺陷导致的细胞表型和分子机制。

本研究运用的关键技术方法包括：对纤毛病患者队列进行遗传学筛查（如靶向测序、外显子组/基因组测序）以识别CEP76变异；利用患者来源的原代成纤维细胞和siRNA（小干扰RNA）介导的CEP76敲低细胞模型评估纤毛发生、纤毛长度、过渡区（transition zone）结构以及鞭毛内运输（IFT）的功能；建立cep76斑马鱼突变体以模拟视网膜变性和视觉功能缺陷等临床表型；通过体外互补实验（如Centrin1点计数分析）验证CEP76变异的功能后果；并采用免疫共沉淀结合质谱分析（Co-IP/MS）来鉴定CEP76的相互作用蛋白网络。

临床和遗传学发现提示CEP76与纤毛病相关

研究人员最初在一个患有BBS样综合征（Bardet-Biedl syndrome-like syndrome）的先证者（家族1）中，通过靶向测序发现了CEP76的复合杂合（compound heterozygous）移码变异（frameshift variants）。随后的国际协作和基因匹配平台（GeneMatcher）又发现了7个携带CEP76双等位基因变异的无关家系。这些患者表现出广泛的临床特征，最常见的包括眼部异常（7/8，如视网膜色素变性）、神经解剖学或头部大小异常（5/8）、肌张力低下（4/8）以及智力障碍/发育迟缓（3/8）等。CEP76的变异谱包括错义变异（missense variants）、剪接位点变异（splice-site variants）和移码/缺失变异，所有这些变异在人群数据库中均极为罕见或不存在，且生物信息学预测其具有有害性。通过RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）和RNA测序（RNA-seq）对特定剪接变异的分析，证实了这些变异导致异常的mRNA剪接，支持了其致病性。

CEP76缺失导致原代成纤维细胞和RPE1细胞出现纤毛发生缺陷

为了研究CEP76缺陷的细胞表型，研究人员分析了来自患者（家族7）的原代皮肤成纤维细胞。免疫荧光显示，患者细胞中心体/基体处的CEP76信号强度显著降低。在血清饥饿诱导纤毛形成后，患者细胞的纤毛形成率（ciliation percentage）显著低于对照细胞。同样，在小干扰RNA（siRNA）敲低CEP76的RPE1细胞中也观察到了纤毛形成受损，表明CEP76对纤毛发生是必需的。

CEP76缺失改变初级纤毛形态并损害顺向IFT

对患者成纤维细胞的进一步分析揭示，CEP76缺陷细胞的纤毛长度显著短于对照，且纤毛体积减小、形状复杂性（shape complexity）增加，提示纤毛结构异常。通过IFT88（ intraflagellar transport 88）的免疫染色评估顺向鞭毛内运输（anterograde IFT）发现，患者纤毛轴丝中的IFT88信号强度显著降低，并且IFT88在纤毛基部的积累比例增加，表明CEP76缺失损害了IFT88介导的顺向运输。

CEP76缺失破坏中心体调控和过渡区组装

研究人员还检查了中心体调控蛋白CCP110和过渡区蛋白CEP290的定位。CEP76缺陷细胞中显示CCP110焦点数增多的细胞比例更高，提示中心体过度复制或成熟受损。同时，一部分患者细胞缺乏可检测的 centrosome CEP290信号，而在CEP290信号可检测的细胞中，其荧光强度反而显著增加，表明CEP76缺失导致了过渡区（transition zone）的组织结构紊乱。

cep76斑马鱼突变体表现出视网膜变性和视觉功能缺陷

为了在体内模型中验证CEP76的功能，研究团队利用CRISPR-Cas9技术构建了cep76斑马鱼突变体。虽然突变体在发育上没有明显的形态异常，但在5天大的幼虫中，其视网膜光感受器细胞出现了视紫红质（rhodopsin）在inner segment（IS）的错误定位，这与已知的纤毛病基因bbs4突变体的表型相似。此外，突变体视网膜光感受器连接纤毛的长度也显著缩短。在5月龄的成年斑马鱼中，cep76纯合突变体的视网膜外核层（ONL）厚度显著减少，表明出现了进行性的光感受器退化。行为学分析（DanioVision locomotion assay）进一步显示，无论是幼虫还是成年斑马鱼，cep76突变体在明暗交替循环中的活动性均显著降低，证实了其视觉功能受损。

CEP76变异无法调控中心体过度复制

为了直接评估在患者中发现的CEP76变异的功能后果，研究人员采用了体外互补实验。他们在U2OS细胞中敲低内源性CEP76，这会诱导中心体过度复制（表现为Centrin1标记的点数超过4个的细胞比例增加）。然后，通过外源表达野生型（WT）CEP76可以挽救这种表型，而表达患者来源的错义变异（如p.Val24Asp, p.Ile101Thr等）则无法有效挽救中心体过度复制的表型，证明了这些变异导致CEP76功能丧失（loss of function）。利用羟基脲（hydroxyurea, HU）诱导中心体扩增的实验也验证了这一结论。

CEP76短亚型无法改善中心体增殖缺陷

研究人员还探讨了CEP76一个较短的转录本亚型（short isoform，缺乏第4外显子）的功能。值得注意的是，一些患者的错义变异（如p.Ile101Thr）位于该短亚型缺失的区域。然而，体外实验表明，表达CEP76短亚型并不能挽救CEP76敲低或HU诱导的中心体增殖缺陷，说明在调控中心体复制方面，长亚型（long isoform）是主要的功能形式，短亚型无法补偿其功能丧失。

蛋白质组学研究提示CEP76参与中心体-纤毛界面

为了无偏倚地探索CEP76的相互作用网络，研究人员在U2OS细胞中过表达mCherry标记的CEP76，然后通过免疫共沉淀结合质谱分析（Co-IP/MS）来鉴定其相互作用蛋白。结果不仅确认了已知的相互作用蛋白，如CCP110和CEP97，还发现了新的、具有临床和功能相关性的候选蛋白，如ALMS1（与Alstrom综合征相关）和LUZP1（与纤毛发生和actin调控相关）。GO（Gene Ontology）富集分析显示，CEP76相互作用蛋白显著富集于中心体、微管等细胞组件。通过免疫印迹（Western blot）验证了CEP76与CCP110和LUZP1的直接物理相互作用。进一步的基因扰动富集分析（RummaGEO GenePerturbations）也将CEP76相互作用蛋白与纤毛发生相关通路联系起来。

综上所述，这项研究通过多学科交叉的方法，首次将CEP76确立为一个新的纤毛病致病基因。研究结果表明，CEP76的功能远不止于调控中心体复制，它在纤毛组装、过渡区结构维持以及鞭毛内运输等过程中都发挥着关键作用。CEP76的缺陷会破坏中心体-纤毛界面的完整性，从而导致多器官系统的功能障碍，这解释了患者中观察到的临床谱系。该研究不仅扩展了我们对纤毛病遗传基础的认识，也为深入理解中心体-纤毛生物学提供了新的分子机制见解。蛋白质组学分析所揭示的CEP76相互作用网络，为进一步研究其在不同细胞 contexts 下的功能以及与其他纤毛病蛋白的协同作用奠定了基础。