基因治疗泡沫床旁制造工程化干细胞：革新造血干细胞基因治疗的新策略

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：Bedside manufacturing of engineered stem cells using gene therapy foam

本研究针对造血干细胞(HSC)基因治疗存在的高成本、可及性差等技术瓶颈，开发了一种基于甲基纤维素泡沫的床旁细胞制造策略。研究人员将新鲜分离的骨髓穿刺浓缩物(BMAC)与含有基因治疗载体的泡沫混合后直接回注骨髓，实现在低载体剂量下对CD34+ HSC的高效基因重编程。该技术可显著提高基因转导效率（慢病毒10倍，mRNA脂质纳米颗粒26倍），同时减少脱靶事件，为推进HSC基因治疗的临床转化提供了新思路。

　　

在基因治疗飞速发展的今天，造血干细胞(HSC)基因治疗为遗传性血液疾病、癌症和传染病患者带来了新的希望。2023年12月，美国FDA批准了两种治疗镰状细胞病的HSC基因疗法Casgevy和Lyfgenia，这标志着该领域的重要突破。然而，光环背后却隐藏着严峻的现实：在美国约10万患者中，仅有0.1%能够获得治疗，高昂的费用（每例200-300万美元）和长达6个月的制造周期成为了难以逾越的障碍。

传统HSC基因治疗需要将细胞从患者体内取出，在符合良好生产规范(GMP)的洁净设施中进行体外培养和基因修饰，这一复杂过程不仅成本高昂，还可能导致HSC干性丧失。更令人担忧的是，治疗过程中的预处理化疗可能引发不育等严重副作用，使得许多患者望而却步。即便有新兴的床旁自动化封闭制造系统（如Clin-iMACS Prodigy）将制造时间缩短至2天，但其仍依赖于传统的多步骤流程，无法从根本上解决成本和技术门槛问题。

面对这些挑战，Fred Hutchinson癌症中心的Matthias T. Stephan团队独辟蹊径，在《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》上发表了一项创新研究，提出了一种革命性的床旁干细胞制造策略。该技术灵感来源于日常生活中常见的泡沫，研究人员巧妙地将基因治疗载体包裹在甲基纤维素泡沫中，与新鲜分离的骨髓细胞混合后直接注射回骨髓，实现了在患者体内直接对HSC进行基因重编程的目标。

研究人员采用了几项关键技术方法：首先建立了甲基纤维素泡沫制备工艺，通过双注射器混合法将基因治疗载体（慢病毒或mRNA脂质纳米颗粒LNP）均匀嵌入泡沫薄层；使用来自健康供者外周血或骨髓穿刺的CD34⁺ HSC进行实验；开发了离体骨髓灌注模型模拟体内环境；通过流式细胞术评估基因转导效率和细胞表型，并利用集落形成单位(CFU)实验评估HSC功能。

Co-embedding gene therapy vector and progenitor cells in foam

研究人员首先验证了将人HSC嵌入甲基纤维素泡沫薄层的可行性。通过光学显微镜观察发现，细胞均匀分布在泡沫薄层中自由漂浮，平均尺寸（10.1μm）远小于泡沫气泡（150μm）。更重要的是，与常规悬浮培养相比，从成熟泡沫中释放的干细胞在24小时后仍保持高活力，细胞得率也无显著差异。时间推移记录显示，在重力作用下，含有细胞的液体在约24小时内完全从泡沫中排出，积累在培养容器底部。

Benefit of foam for gene transfer into HSCs

基因转导效率对比实验显示了泡沫系统的显著优势。当使用基于Moderna COVID-19疫苗配方的GFP mRNA LNPs时，泡沫中转染效率达到59.5%±8.7%，而悬浮组仅为2.3%±0.9%。同样，在低感染复数(MOI=1)下，泡沫中的慢病毒转导效率（35.9%±4.9%）是悬浮组（3.5%±0.4%）的10倍，且细胞活力未受影响。添加化学转导增强剂Polybrene并未进一步提升泡沫的基因转移效力。

Stem cell functionality after foam transfection

功能学实验表明，甲基纤维素泡沫转染不影响HSC的增殖、表型和自我更新能力。在7天培养期间，泡沫转染的HSC与未修饰细胞具有相似的扩增能力和表型特征。集落形成实验进一步证实，泡沫转染的HSC仍保持形成多系落的能力，表明该技术不会触发造血祖细胞的不良分化。

Vector retention at administration site

通过离体骨髓灌注模型，研究人员评估了泡沫在模拟体内环境中的表现。将含有荧光素酶mRNA LNPs的基因治疗制剂注射到纤维素支架中，24小时后检测基因转移情况。结果显示，泡沫制剂在靶点处的转染效率比悬浮制剂高29.7倍，且能将84.7%的基因转移限制在靶点区域，而悬浮制剂96.7%的基因转移发生在脱靶位置，证实泡沫能有效保留载体和HSC在注射部位。

Compatibility of gene therapy foam approach with human BMAC

为验证技术与临床流程的兼容性，研究人员使用从健康志愿者获取的骨髓穿刺液制备BMAC，30分钟内即可获得含有8.3%±2.4% CD34⁺细胞的浓缩产物。实验表明，泡沫在BMAC环境中仍能实现高效基因转导（57.8%±6.5%），效率是悬浮组的26.6倍，且不影响细胞活力。

该研究的创新性在于将复杂的体外细胞制造过程简化为单一的床旁操作，避免了传统方法中细胞培养导致的干性丧失问题。由于HSC离开生理环境仅约30分钟，能更好地保持其完整的干细胞特性。值得注意的是，该技术非选择性修饰BMAC中的所有细胞类型，但由于仅HSC具有自我更新能力，治疗相关的永久性基因修饰将仅限于CD34⁺ HSC及其后代细胞。

研究人员也客观讨论了技术的潜在风险和局限性。静脉空气栓塞是可能的安全性顾虑，但研究表明，甲基纤维素微泡沫会逐渐成熟，任何截留的空气都会在数小时内缓慢释放，容易被吸收。此外，离体模型无法完全复制生物体内复杂环境，未来需要在非人灵长类动物中进行全面评估。

这项研究为推进HSC基因治疗的临床转化提供了新范式。泡沫床旁制造策略有望解决当前治疗面临的三大核心问题：通过简化流程降低成本和基础设施门槛；在门诊环境中进行治疗，减少对患者日常生活的干扰；必要时可重复给药，提高治疗灵活性。随着进一步优化和验证，该技术有望使HSC基因治疗变得更加高效、经济、可及，让更多患者受益于这一前沿医疗技术。