小鼠模型中通过种系靶向mRNA-LNP免疫原同时激活多表位HIV广谱中和抗体前体

《Science Immunology》：Simultaneous priming of HIV broadly neutralizing antibody precursors to multiple epitopes by germline-targeting mRNA-LNP immunogens in mouse models

为解决HIV疫苗开发中多表位广谱中和抗体（bnAb）前体同时激活的竞争性问题，研究人员开展mRNA-LNP免疫原鸡尾酒疗法研究，发现其可平衡激活靶向V3-聚糖、V2-顶端、CD4结合位点和MPER表位的四类bnAb前体，并驱动体细胞超突变，为多表位HIV疫苗设计提供关键依据。

　　

HIV病毒因其高度遗传多样性和包膜蛋白（Env）的密集糖基化，给疫苗研发带来巨大挑战。广谱中和抗体（bnAb）能识别Env上的多个保守表位，但野生型Env免疫难以有效诱发bnAb。关键难点在于：成熟bnAb与它们的前体细胞在抗体结构上存在巨大差异，前体B细胞受体（BCR）无法识别成熟bnAb所结合的表位。这催生了种系靶向（Germline-targeting, GT）疫苗策略：首先使用专门设计的"启动免疫原"（priming immunogen）激活携带bnAb前体的幼稚B细胞，再通过后续免疫引导这些细胞沿bnAb成熟路径进化。

虽然针对不同表位的GT免疫原（如CD4结合位点CD4bs、V3-聚糖、V2-顶端和膜近端外部区域MPER）已分别开发成功，但能否同时激活多类前体而不引发抑制性竞争仍属未知。同时，若能在单次接种中递送多免疫原鸡尾酒，将简化免疫流程，提高疫苗可及性。为此，研究团队在《Science Immunology》发表论文，探索了使用mRNA脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）技术同时启动多表位bnAb前体的可行性。

研究采用的关键技术方法包括：利用基因敲入小鼠模型（BG18^Hgl、PCT64^LMCA、CLK09和HuGL18^H）过继转移bnAb前体B细胞至野生型受体；使用蛋白质免疫原（如N332-GT5、ApexGT5三聚体蛋白）和mRNA-LNP编码免疫原（膜锚定三聚体或可溶性纳米颗粒）；通过流式细胞术分析生殖中心（GC）B细胞应答；采用10x Genomics单细胞BCR测序追踪体细胞超突变（SHM）；借助ELISA和电子显微镜多克隆表位定位（EMPEM）评估血清抗体反应。

Coadministration of protein trimer immunogens targeting BG18-class/V3-glycan and PCT64-class/V2-apex precursors efficiently activates BG18-class precursors

研究发现，当使用Sigma佐剂共同注射N332-GT5（靶向V3-聚糖表位）和ApexGT5（靶向V2-顶端表位）蛋白三聚体时，虽能诱导强烈的GC反应，但GC中的抗原特异性B细胞几乎全部为N332-GT5结合细胞，ApexGT5特异性反应微弱。BCR测序显示，BG18前体重链（HC）积累了核苷酸和氨基酸突变，而PCT64前体序列回收率极低，表明蛋白共免疫存在显著竞争，不利于V2-顶端前体激活。

Increased precursor frequencies enhance PCT64-class/V2-apex responses after dual protein trimer immunization

通过提高过继转移的PCT64^LMCA前体B细胞频率（从10:10⁶增至100:10⁶），研究发现高频组在免疫后14天能显著增加GC中ApexGT5⁺CD45.2 B细胞比例，但到28天时优势消失。突变分析显示，提高前体频率并未显著改变BG18或PCT64 HC的突变水平，但V2-顶端应答在一定程度上得到改善。

An mRNA-LNP cocktail activates both BG18-class/V3-glycan and PCT64-class/V2-apex bnAb precursors efficiently

转折点出现在使用mRNA-LNP递送系统时。当N332-GT5和ApexGT5以mRNA-LNP形式（剂量各3.8 μg）肌注免疫时，双免疫组与单免疫组诱导的GC大小无显著差异，且GC中CD45.2细胞比例在28天时高达40%。重要的是，双免疫不仅未抑制各自特异性反应，反而使ApexGT5⁺KO^-细胞比例有所提升。血清IgG滴度相当，且BCR测序显示，两组前体均有效积累突变，其中LMCA PCT64 HC在双免疫后突变数量甚至超过单免疫组。膜锚定形式（对比可溶性形式）的ApexGT6 mRNA-LNP实验证实，膜结合抗原呈现能更大程度激活PCT64前体，表明其可能通过降低前体激活阈值来缓解竞争。

BG18-class/V3-glycan and PCT64-class/V2-apex respond to mRNA-LNP cocktails when potential competitors are abundant

即便在10倍频率变化范围内，mRNA-LNP鸡尾酒免疫仍能保持稳定的GC反应和CD45.2细胞参与度，表明其应答对前体频率变化不敏感。高频或低频转移下，特异性B细胞比例和血清抗体滴度均无显著差异，SHM热点突变模式也高度一致，证明mRNA-LNP平台在多表位启动中具有良好鲁棒性。

VRC01-class bnAb precursors to the CD4bs can be activated in tandem with PCT64-class/V2-apex or BG18-class/V3-glycan bnAb precursors

研究进一步扩展至第三表位。将PCT64^LMCA（V2-顶端）与CLK09（VRC01类，靶向CD4bs）前体共转移，并共同免疫ApexGT5三聚体蛋白和eOD-GT8 60mer纳米颗粒（NP）蛋白。结果显示，GC中CD45.2细胞主要为eOD-GT8特异性结合细胞，ApexGT5应答再次受限。而换用mRNA-LNP鸡尾酒（膜锚定ApexGT5三聚体+可溶性eOD-GT8 60mer）后，GC中两类前体比例在28天时达到平衡（各约30%），血清中针对两种表位的特异性IgG也成功检出。同样，eOD-GT8 60mer mRNA-LNP与N332-GT5三聚体mRNA-LNP共免疫也能有效激活BG18类和VRC01类前体，且不影响彼此SHM进程。

Germline precursors to bnAbs targeting three distinct epitopes can be activated simultaneously

研究最终挑战同时启动三类前体。将BG18^Hgl、PCT64^LMCA和CLK09前体共转移，并使用包含N332-GT5三聚体、ApexGT5三聚体和eOD-GT8 60mer的mRNA-LNP鸡尾酒进行低（0.5 μg each）、中（2 μg each）、高（10 μg each）剂量免疫。所有剂量组均成功诱导GC反应，并在GC和总B细胞中检测到三类表位特异性结合细胞。较高剂量产生较大GC，但CD45.2细胞比例无剂量依赖性。血清ELISA显示，所有组别均产生针对三种抗原的特异性IgG，其中N332-GT5的ΔAUC最高。EMPEM分析检测到针对V3-聚糖表位的多克隆抗体反应，且其结合模式与单免疫原启动时高度重叠。BCR测序证实三类前体HC均随时间积累突变，并呈现谱系多样化。

Precursors targeting four distinct epitopes can be activated simultaneously

最终，研究成功整合第四类表位。在原有三类前体基础上，加入靶向MPER表位的HuGL18^H前体（频率100:10⁶），并使用四联mRNA-LNP鸡尾酒（新增10E8-GT12 24mer）。四重免疫后，GC中可检测到所有四种表位特异性CD45.2 B细胞，其中10E8-GT12特异性比例较低，但仍显著。血清中针对各抗原的特异性IgG均成功检出，BCR测序显示所有四类前体HC均有效发生SHM，并获得关键成熟突变或轨道中间突变。

研究结论表明，使用mRNA-LNP递送GT免疫原鸡尾酒，能有效克服多表位bnAb前体同时激活时的竞争问题，成功实现V3-聚糖、V2-顶端、CD4bs和MPER四类前体的平衡启动和亲和力成熟。其成功关键在于mRNA-LNP平台，特别是膜锚定抗原呈现，能降低低亲和力前体的激活阈值。此外，mRNA-LNP免疫应答对前体频率和剂量变化不敏感，显示出良好的临床转化潜力。尽管启动后抗体尚未获得对天然假病毒的中和能力（IC₅₀ > 50 μg/ml），但体细胞超突变已沿正确路径积累，为后续加强免疫引导至成熟bnAb奠定基础。该研究为开发多表位HIV疫苗提供了原则性验证和实用策略，极大简化了免疫方案，有望提升疫苗依从性和有效性。