组合靶向祖细胞免疫策略在非人灵长类动物中同步诱导多类广谱中和抗体前体

《Science Immunology》：Simultaneous induction of multiple classes of broadly neutralizing antibody precursors by combination germline-targeting immunization in nonhuman primates

本研究针对HIV疫苗研发中难以同时诱导多类广谱中和抗体(bnAb)的挑战，探讨了组合使用靶向不同HIV包膜蛋白表位（V3-聚糖/N332超位点、V2顶端区和膜近端外部区MPER）的祖细胞靶向(GT)免疫原的可行性。研究发现在非人灵?动物中，三联组合免疫虽暂时降低部分表位反应，但最终成功激活了所有三类bnAb前体细胞谱系，且体细胞高频突变(SHM)水平相当。该结果为开发多靶点HIV疫苗策略提供了重要依据。

　　

在全球抗击HIV/AIDS的战役中，有效疫苗的研发仍是重大挑战。尽管广谱中和抗体(broadly neutralizing antibodies, bnAbs)能识别HIV包膜蛋白(Env)上的保守表位，为疫苗设计提供了希望，但如何诱导人体产生这类抗体却困难重重。其中一个核心难题是"免疫显性"现象——免疫系统往往会优先针对某些表位产生反应，而忽略那些可能更重要但更难触及的保守区域。这些保守表位通常隐藏在Env蛋白的聚糖屏障之下，需要特殊的B细胞受体（如具有长CDR3环的抗体）才能结合，而这类B细胞在人体内十分罕见且亲和力低。

为了解决这一难题，科学家们开发了"祖细胞靶向"(germline-targeting, GT)疫苗策略。该策略通过设计特殊的免疫原，增强其与bnAb前体细胞的初始结合能力，从而激活这些稀有细胞。虽然针对单个表位的GT免疫原（如靶向CD4结合位点的VRC01类抗体）已在动物模型和临床试验中显示出潜力，但单一bnAb无法中和所有HIV毒株。要实现全面保护，必须同时诱导针对多个不同表位的bnAb类别。

这就引出了一个现实问题：如果每个bnAb类别都需要单独的免疫流程，那么疫苗接种次数将变得不切实际。能否将多个GT免疫原组合在一起，通过一次免疫同时激活多个bnAb谱系？这种组合策略是否会因免疫原之间的竞争而影响效果？这些正是本研究要回答的关键问题。

为了探索这一前沿问题，研究团队在^{Science Immunology}上发表了一项创新性研究。他们在非人灵长类动物（印度食蟹猴）模型中，系统评估了同时使用三种GT免疫原的可行性和效果。这三种免疫原分别靶向HIV Env上的三个关键保守表位：N332-GT5靶向V3-聚糖/N332超位点（诱导BG18类bnAb前体）、Apex-GT6靶向V2顶端区（诱导PCT64类bnAb前体）、以及10E8-GT12 24mer纳米颗粒靶向膜近端外部区(membrane-proximal external region, MPER)（诱导10E8类bnAb前体）。

研究采用的关键技术方法包括：使用皂苷/单磷酰脂质A纳米颗粒(SMNP)佐剂的蛋白免疫方案；通过多色流式细胞术（九种探针六色方案）同时检测多个表位特异性B细胞；利用液滴式单细胞RNA测序分析B细胞受体(BCR)序列和bnAb前体特征；以及假病毒中和实验评估血清抗体功能。研究纳入了36只印度食蟹猴，分为六组，分别接受单一、双重或三重GT免疫原组合的免疫。

实验设计

研究人员将动物分为六组（每组n=6），分别接受：单独N332-GT5、单独10E8-GT12 24mer、单独Apex-GT6、N332-GT5+Apex-GT6、N332-GT5+10E8-GT12 24mer、或三重组合免疫。所有组别均采用指数递增剂量(exponentially escalating dose, ED)方案进行初免和加强免疫，通过皮下注射途径给药，并在特定时间点采集血液样本进行分析。

针对GT免疫原的靶向IgG反应

通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中的靶向免疫球蛋白G(IgG)反应发现，初免后所有组别均产生了强烈的靶向反应。虽然三重组合免疫在加强免疫后两周暂时提高了对N332-GT5和Apex-GT6的IgG反应，但这些差异在八周后消失。值得注意的是，N332-GT5+10E8-GT12组合在所有时间点均诱导了显著更高的10E8特异性IgG反应。

组合免疫后表位特异性靶向B细胞反应的时序动态

利用精心设计的流式细胞术面板，研究人员成功同时鉴定了针对三种GT免疫原的表位特异性记忆B细胞(B_Mem)。初免后10周，所有接受相应免疫原的动物均检测到表位特异性B_Mem细胞。虽然三重组合免疫导致Apex-GT6特异性B_Mem细胞反应暂时降低，但加强免疫后八周，所有三类表位的bnAb前体谱系均可在100%的动物中检测到。重要的是，当仅使用两种Trimer免疫原（N332-GT5+Apex-GT6）组合时，未观察到竞争现象。

组合免疫后多类bnAb样前体细胞的激活

通过单细胞测序分析，研究人员成功鉴定出BG18类、PCT64类和10E8类bnAb前体细胞。在加强免疫后两周，86%的动物检测到N332-GT5⁺ BG18类B_Mem细胞，89%的动物检测到Apex-GT6⁺ PCT64类B_Mem细胞，所有接受10E8-GT12的动物均产生10E8-GT12⁺⁺ 10E8类B_Mem细胞。虽然三重组合免疫导致部分前体细胞频率暂时降低，但到八周后，这些差异基本消失。特别值得一提的是，研究还发现10E8-GT12能够同时激活MPER特异性的LN01类bnAb前体。

体细胞高频突变、同种型和中和活性不受组合免疫影响

对表位特异性B细胞的重链分析显示，无论单独免疫还是组合免疫，体细胞高频突变(somatic hypermutation, SHM)水平均无显著差异。中和实验结果表明，三重组合免疫诱导的针对V3-聚糖超位点的功能性抗体反应与单独免疫相当，表明免疫原组合使用不影响抗体质量。

研究结论与讨论部分指出，这项研究首次在非近交系动物模型中证明，通过组合GT免疫策略可以同时诱导针对多个HIV Env表位的bnAb前体细胞。尽管存在暂时的免疫竞争（特别是与高价态纳米颗粒免疫原共同使用时），但这种竞争效应会随时间减弱，且不影响最终的B细胞记忆形成和抗体质量。

该研究的创新性在于突破了单一靶向的限制，为开发实用化的多靶点HIV疫苗奠定了基础。值得注意的是，10E8-GT12 24mer纳米颗粒表现出较强的免疫显性，这可能与其高价值（24个结合位点）和较高的前体细胞频率有关。未来研究可探索平衡免疫原价态或采用mRNA-LNP等新型递送平台来优化反应平衡。

总之，这项发表在^{Science Immunology}上的工作证实了"组合祖细胞靶向免疫"策略的可行性，为解决HIV疫苗研发中的关键瓶颈提供了重要路径。它不仅对HIV疫苗领域有直接意义，也为其他需要诱导多靶点免疫反应的疫苗研发提供了宝贵参考。