基于酶切反应的抗体药物偶联物中组织蛋白酶可裂解连接头-药物的手性纯度评估新平台

《Analytica Chimica Acta》：Enzymatic Assay Based Platform for the Chiral Purity Assessment of Cathepsin-Cleavable Antibody-Drug Conjugate Linker-Drugs

本综述介绍了一种创新的酶消化检测法（使用蛋白酶papain），用于选择性消化抗体药物偶联物（ADC）中组织蛋白酶可裂解连接头-药物（LD）的所需（S）-瓜氨酸差向异构体。该方法通过标准反相液相色谱法（RPLC）定量未消化的（R）-差向异构体，避免了传统手性色谱法（如手性超临界流体色谱SFC）所需的冗长方法开发和难以合成的杂质标准品。该平台方法具有高线性（R2 > 0.999）、特异性及与SFC的正交性，适用于多种连接头格式（如Sq-Cit、Val-Cit、GGFG），为ADC治疗剂的早期工艺开发和优化提供了高效、可靠的的分析工具。

　　

章节亮点

材料

本研究评估了四种可裂解连接头-药物（LDs）。马来酰亚胺己酰-缬氨酸-瓜氨酸-单甲基奥瑞他汀E（MC-vc-MMAE）、LD1和LD2为内部合成（Genentech, Inc.）。LD1和LD2是专有的连接头-药物，含有MC-Sq（环丁烷-1,1-二甲酰胺）-cit-PAB连接头支架，已知可被组织蛋白酶B（Cathepsin B）优先裂解，并带有不同的细胞毒性载荷。一种含有马来酰亚胺-GGFG肽连接头和细胞毒性载荷的连接头-药物（LD3）也用于本研究。所有LDs均以冻干粉形式提供，并在使用前溶解在二甲基亚砜（DMSO）中。来自木瓜（Carica papaya）的木瓜蛋白酶（Papain）购自Sigma-Aldrich。所有其他化学品和溶剂均为HPLC级别或更高纯度。

基于作用机制（MoA）的瓜氨酸手性纯度检测策略

这项工作的基本原理是利用一种蛋白酶选择性地、完全地消化可裂解连接头-药物中具有生物活性的（S）-差向异构体，而保留无活性的（R）-差向异构体完整。然后，可以通过标准反相液相色谱法（RPLC）对剩余的未消化材料进行定量，作为初始（R）-差向异构体杂质含量的直接替代指标（图1）。这种方法规避了对手性色谱和（R）-差向异构体参考标准品合成的需求。

该方法成功的关键前提是所选的蛋白酶必须能够区分瓜氨酸残基的（S）和（R）构型，类似于组织蛋白酶B的作用方式。我们选择了木瓜蛋白酶（Papain），这是一种研究充分、易于获得且成本相对较低的半胱氨酸蛋白酶，已知其对肽底物具有广泛的特异性，并能识别与组织蛋白酶B相似的氨基酸序列。通过实验设计（DOE）系统优化了消化条件（如酶浓度、pH值、温度、时间），以确保（S）-差向异构体的完全消化，同时保证（R）-差向异构体的稳定性，从而建立了稳健的检测方案。

结论

在这项工作中，我们成功开发并验证了一种新颖的、反映作用机制（MoA）的酶检测法，用于即时评估组织蛋白酶可裂解连接头-药物的手性纯度。这种基于木瓜蛋白酶的消化方法为传统色谱技术提供了一种实用且稳健的替代方案，规避了专用手性色谱柱的需求，并且最重要的是，避免了相应（R）-差向异构体杂质标准品资源密集型的合成。该方法经过优化，具有高线性、特异性和与手性超临界流体色谱（SFC）的正交性。其平台通用性通过对多种连接头格式（包括Sq-Cit、Val-Cit和GGFG序列）的成功应用得到证实。该方法能够区分具有不同差向异构体水平（1.9% vs. 9.9%）的生产批次，展示了其实际效用。将该检测法与质谱（MS）联用进一步扩展了其在对发色团较弱的底物中的应用。这种“适合目的”的酶检测法为加速ADC治疗剂的工艺理解和优化，特别是在工艺开发的最早阶段，提供了一个宝贵且高效的分析工具。