靶向PKCε-RACK2相互作用的细胞穿透肽KIKIC：治疗2型糖尿病的新策略

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》：Cell-penetrant peptides as novel inhibitors of the interaction of coatomer protein COPB2/RACK2 with protein kinase Cε and cargo proteins

本研究针对蛋白激酶Cε（PKCε）与受体蛋白RACK2（COPB2）异常相互作用在2型糖尿病（T2DM）等疾病中的关键作用，开发了源自PKCε序列的细胞穿透肽抑制剂。研究发现，含有KxKxx模体的五肽KIKIC能高效抑制PKCε-RACK2相互作用（IC50≈0.8 μM），并展现细胞穿透性且无细胞毒性。通过蛋白质组学分析，揭示了PKCε-RACK2复合物参与蛋白酶体功能调节等新机制，为开发靶向该相互作用的肽类或拟肽药物治疗T2DM提供了新思路。

　　

在细胞信号传导的复杂网络中，蛋白激酶C（PKC）家族扮演着至关重要的角色。其中，新型PKC亚型PKCε（Protein Kinase C epsilon）因其在多种生理和病理过程中的作用而备受关注。这种脂质激活的激酶不仅是细胞生长、存活和代谢的关键调节因子，其异常激活更被证实与一系列重大人类疾病密切相关，包括2型糖尿病（T2DM）、癌症、心脏肥大、疼痛和焦虑障碍。特别是在2型糖尿病的发病机制中，PKCε的过度激活会破坏葡萄糖稳态，影响胰腺β细胞的胰岛素分泌和靶组织对胰岛素的反应，导致胰岛素抵抗。

然而，直接抑制PKCε的催化活性面临巨大挑战。由于所有PKC亚型的ATP结合位点高度保守，开发选择性抑制剂极为困难。因此，研究人员将目光转向了更具选择性的调控策略——靶向PKCε与特定支架蛋白的相互作用。早在二十多年前，科学家就发现PKCε的功能发挥依赖于其与受体蛋白RACK2（Receptor for Activated C Kinase 2，也称为COPI coatomer复合物的β‘-亚基COPB2）的相互作用。这种相互作用对于PKCε在细胞内的正确定位和功能至关重要。阻断PKCε-RACK2相互作用，理论上可以特异性干扰PKCε的信号传导，而不影响其他PKC亚型，从而为治疗相关疾病提供了一种潜在的高选择性策略。

尽管已知PKCε衍生的八肽εV1-2能够抑制PKCε与RACK2的结合，并被广泛用作PKCε的功能拮抗剂，但其作用机制和有效性仍有待深入探究。更重要的是，将肽类药物有效递送至细胞内作用靶点一直是药物开发的瓶颈。这些问题促使由澳大利亚莫纳什大学药物科学研究所的Abisola A. Olushola-Siedoks、Raymond S. Norton和Carsten Schmitz-Peiffer等领导的研究团队开展了这项创新性研究，旨在发现更有效、能够穿透细胞的肽类抑制剂，并深入探索PKCε-RACK2相互作用的生物学意义。

研究人员建立了一套完整的研究体系，主要关键技术包括：基于化学发光技术的Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay（AlphaScreen）用于高通量筛选PKCε-RACK2相互作用的抑制剂；固相肽合成技术用于制备各种PKCε衍生肽及其修饰类似物；Split Luciferase Endosomal Escape Quantification（SLEEQ） assay用于定量评估肽的细胞穿透能力和内体逃逸效率；蛋白质组学技术（包括基于质谱的蛋白质鉴定和定量分析）用于鉴定与RACK2或PKCε-RACK2复合物相互作用的蛋白质；Bimolecular Complementation Affinity Purification（BiCAP）技术用于从完整细胞中特异性分离PKCε-RACK2复合物。研究中使用的肝蛋白裂解液来源于普通饮食喂养的小鼠肝脏。

3.1. KIKIC是PKCε-RACK2相互作用的强效抑制剂

研究人员首先建立了一种灵敏的AlphaScreen检测方法，用于定量全长PKCε与RACK2之间的直接结合。该方法利用His₆标签的PKCε与镍螯合物包被的受体微珠结合，生物素化的RACK2与链霉亲和素包被的供体微珠结合。当PKCε与RACK2相互作用时，两种微珠靠近产生化学发光信号。研究人员发现，在二酰基甘油（DAG）和磷脂酰丝氨酸（PS）存在的条件下，PKCε与RACK2的结合显著增强，这与PKCε作为脂质激活激酶的属性一致。

令人意外的是，已知的PKCε拮抗剂肽εV1-2本身对PKCε-RACK2相互作用的抑制活性很弱。然而，当εV1-2与细胞穿透肽（CPP）TAT或CPP9缀合后，抑制活性显著增强。进一步的对照实验表明，这种抑制活性主要来自于TAT和CPP9序列本身，而非εV1-2序列。这一发现提示，带正电荷的序列可能在抑制PKCε-RACK2相互作用中发挥关键作用。

考虑到RACK2作为COPI外壳蛋白复合体β‘-亚基，已知能够识别并结合蛋白质货物中的双赖氨酸（dilysine） motifs，研究人员检查了PKCε的序列，发现了多个潜在的dilysine motifs，包括KxKxx、KKxx和RKxx模式。他们合成了PKCε中第一个这样的序列——KIKIC（对应PKCε_9-13位氨基酸），并发现这个五肽能够强效抑制PKCε-RACK2相互作用，IC₅₀约为0.8 μM。

为了探究抑制活性的特异性，研究人员系统性地合成了PKCε中其他的KxKxx、KKxx和RKxx motif肽段进行测试。结果显示，KxKxx motif的肽段（如KIKIC、KQKTN和KTKRD）在10 μM浓度下表现出最强的抑制活性，而KKxx和RKxx motif的肽段抑制活性则弱得多。两个KxKxx motif肽段KGKDE和KIKPP几乎没有抑制活性，表明并非所有KxKxx序列都能有效抑制。

接下来，研究人员通过丙氨酸扫描和定点突变深入研究了KIKIC的结构-活性关系。结果表明，KIKIC中的两个赖氨酸残基（Lys1和Lys3）以及C末端羧酸基团对于抑制活性至关重要。将Lys1突变为丙氨酸会完全丧失活性，将Lys3突变为丙氨酸则导致活性显著降低。同样，将C末端羧酸酰胺化也会几乎完全消除抑制活性。相比之下，第2位和第4位的异亮氨酸对活性的影响较小，而将C末端的半胱氨酸替换为丙氨酸得到的类似物活性与KIKIC相当甚至略优。此外，KIKIC的二硫键类似物也保持了完全活性。

3.2. KIKIC能够进入细胞质

由于KIKIC带有正电荷，且大小与一些已知的细胞穿透肽相似，研究人员推测它可能具有细胞穿透能力。他们采用SLEEQ assay来定量评估KIKIC的细胞摄取和内体逃逸效率。实验结果显示，与对照HiBiT肽相比，KIKIC-HiBiT在RAW 264.7巨噬细胞中产生了显著更高的胞质荧光信号，表明KIKIC能够增强其胞质递送。然而，KIKIC-HiBiT的内体逃逸效率较低，与HiBiT对照没有显著差异。这表明KIKIC与其他阳离子细胞穿透肽类似，主要通过增加细胞结合而非直接促进内体逃逸来增强胞质递送。

3.3. KIKIC及其类似物未显示细胞毒性

为了评估KIKIC作为治疗候选物的安全性，研究人员通过碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色检测了其对RAW 264.7巨噬细胞和HepG2肝细胞的细胞毒性。结果表明，在5-10 μM的浓度下（足以完全抑制PKCε-RACK2相互作用），KIKIC及其HiBiT缀合物在长达12小时的观察期内均未引起明显的细胞毒性，细胞存活率与阴性对照相当。

此外，研究人员还检测了KIKIC对脂质诱导的PKCε转位（激活的标志）的影响。在经油酸处理的HepG2细胞中，KIKIC能够降低膜相关与胞质PKCε的比例。有趣的是，KIKIC单独处理也能引起PKCε的重新分布，这表明KIKIC对细胞内的PKCε蛋白相互作用具有复杂影响。

3.4. PKCε N末端C2样结构域（C2D）与RACK2的相互作用

此前的研究表明，PKCε的N末端C2样结构域（C2D）包含一个推测的RACK2结合位点。为了验证这一点，研究人员在AlphaScreen assay中将His₆标签的C2D固定化，检测其与可溶性RACK2的结合。出乎意料的是，他们没有观察到明显的信号增强，表明在这种assay条件下，固定化的C2D不能与RACK2相互作用。然而，当加入可溶性的C2D（去除了His₆标签）时，它能够剂量依赖性地抑制全长PKCε与RACK2的结合。这种看似矛盾的结果可能与实验体系中蛋白质的固定化方式有关，提示PKCε与RACK2的相互作用可能涉及多个结构域，且受构象和空间可及性的影响。

3.5. KIKIC在体外抑制RACK2与特定肝脏蛋白的相互作用

为了在更接近生理条件的体系中探索KIKIC的作用，研究人员利用生物素化的RACK2对小鼠肝脏裂解液进行pull-down实验，并通过定量蛋白质组学分析RACK2的结合蛋白。结果鉴定出78个蛋白质被RACK2显著富集（>5倍），其中21个蛋白质的C末端具有KxKxx、KKxx或RKxx motif，这一比例显著高于小鼠全蛋白质组中的背景分布。特别值得注意的是，26S蛋白酶体的多个核心亚基（如PSMA1、PSMB4等）被RACK2显著富集，并且这种富集对KIKIC处理敏感（KIKIC效应>10）。基因富集分析表明，这些RACK2结合且KIKIC敏感的蛋白质主要参与蛋白质分解代谢和固醇合成过程。

3.6. 从完整细胞中分离特异性结合PKCε-RACK2复合物的蛋白质

为了克服肝脏裂解液中PKCε表达量低难以检测的问题，并研究在更接近生理状态的细胞环境中PKCε-RACK2复合物的组成，研究人员采用了BiCAP技术。他们将PKCε和RACK2分别与Venus荧光蛋白的互补片段融合，在HEK-293T细胞中共表达。当PKCε和RACK2相互作用时，Venus荧光蛋白重构产生荧光信号，证实了它们在细胞内能够形成复合物。利用GFP-Trap纳米抗体，他们特异性分离了PKCε-RACK2复合物，并对其结合蛋白进行了蛋白质组学分析。

在静息状态的细胞中，与PKCε-RACK2复合物结合的蛋白质显著富集于高尔基体-内质网逆行运输等过程，这与RACK2在coatomer复合物中的功能一致。在TPA（佛波醇酯，PKC激活剂）刺激的细胞中，结合的蛋白质则更显著地富集于脂质代谢和线粒体相关过程。特别值得注意的是，在TPA刺激的细胞中，多个蛋白酶体亚基被鉴定为PKCε-RACK2复合物的结合蛋白，而这在静息细胞中并不明显，提示PKCε的激活可能促进了其与蛋白酶体功能的关联。对比肝脏pull-down和细胞BiCAP实验的结果，发现有19个蛋白质在两个实验体系中共同被富集，其中5个具有C末端dilysine motif，它们主要参与蛋白酶体过程和高尔基体运输。

4. 讨论与结论

本研究首次发现并证实了源自PKCε序列的KxKxx motif肽段，特别是KIKIC，是PKCε-RACK2相互作用的强效、选择性抑制剂。其抑制作用依赖于两个关键赖氨酸残基和自由的C末端羧基，这与COPI复合物识别蛋白质货物中dilysine trafficking motifs的分子机制高度相似。AlphaFold3的预测模型显示，KIKIC可能通过模拟trafficking motif，竞争性地结合在RACK2 N末端WD40 β-propeller结构域的中央孔区，从而阻断了PKCε与RACK2的相互作用。

尤为重要的是，KIKIC展现出一定的细胞穿透能力，能够进入细胞质，并且在有效浓度下对巨噬细胞和肝细胞没有毒性，具备了作为细胞内靶向治疗候选分子的潜力。它在细胞模型中能够影响PKCε的脂质诱导转位，进一步证明了其功能性活性。

通过蛋白质组学方法，本研究极大地拓展了对PKCε-RACK2复合物细胞功能的认识。研究发现，该复合物不仅参与已知的高尔基体-内质网运输，还与蛋白酶体功能、脂质代谢酶类的运输等关键细胞过程密切相关。特别是在脂质过度累积的条件下（如肥胖），PKCε的慢性激活可能通过影响coatomer介导的蛋白质运输，导致蛋白酶体功能紊乱和内质网应激，从而加剧胰岛素抵抗。这为理解PKCε在2型糖尿病等代谢性疾病中的具体作用机制提供了新的视角。

综上所述，本研究不仅发现了一类具有开发前景的PKCε-RACK2相互作用抑制剂，为治疗2型糖尿病等疾病提供了新的潜在策略，还深入揭示了PKCε-RACK2相互作用的复杂生物学网络，为后续的基础研究和药物开发奠定了坚实的基础。基于KIKIC的骨架进行优化，设计兼具高抑制活性、良好选择性和优异药代动力学性质的肽类或拟肽物，将是未来研究的重要方向。