荧光蛋白(FPs)中激子耦合的发现：β-桶状结构介导的长距离激子离域及其对生物传感器设计的启示

《Biomedical Signal Processing and Control》：FCE-YOLO: A highly accurate and efficient model for acute lymphoblastic leukemia detection and classification

本研究针对荧光蛋白(FPs)生物传感器中潜在的激子耦合现象及其影响不明的问题，开展了关于FP串联二聚体(TDs)中激子离域的研究。通过构建单/双发色团FP，研究人员观测到吸收红移、圆二色谱Davydov分裂及荧光寿命缩短等现象，证实了激子耦合的存在。光子反聚束实验表明，即使发色团间距达20 nm（远超FRET极限），TDs仍作为单一量子单元发光。该发现揭示了β-桶状结构是FP激子离域的共性结构基础，对生物传感器精准设计和新型激子材料开发具有重要意义。

　　

在生命科学和生物医学工程领域，荧光蛋白(Fluorescent Proteins, FPs)扮演着革命性的角色。从绿色荧光蛋白(GFP)的发现到如今数百种遗传编码生物传感器的开发，这些神奇的“分子灯塔”使得研究人员能够在活细胞中实时观测基因表达、蛋白质定位和分子相互作用等动态过程。然而，在利用这些强大工具的同时，科学家们也逐渐意识到一个潜在的问题：荧光蛋白本身可能存在着复杂的物理现象，这些现象可能会影响实验结果的解读。其中，一种被称为“激子耦合(excitonic coupling)”的现象引起了特别关注。简单来说，当两个或多个发色团（产生颜色的分子）在空间上足够接近时，它们可能会发生相互作用，导致激发态能量不再局限于单个分子，而是在多个分子间“离域(delocalized)”。这种激子离域现象有可能改变荧光蛋白的荧光寿命、强度和光谱特性，甚至在相对较远的距离上产生影响。这就引出了一个关键问题：我们通常基于单个发色团行为的假设来设计和解释生物传感器实验，如果存在未被识别的激子耦合，是否会带来偏差？

更令人困惑的是，激子耦合是否是所有β-桶状(β-barrel)结构荧光蛋白（这是大多数FPs的共同结构特征）的普遍特性？以及，产生这种耦合所需的发色团之间的距离究竟是多少？目前科学界对此尚无明确答案。理解这些问题至关重要，不仅是为了确保生物传感器数据的准确性和可靠性，也为未来设计新型的、基于激子原理的遗传编码功能材料奠定基础。为了解开这些谜团，一项发表在《Biomedical Signal Processing and Control》上的研究应运而生。

为了探究上述问题，研究人员设计了一套巧妙的实验策略。核心在于构建了一系列荧光蛋白构建体，这些构建体被精确设计为包含一个或两个功能性的发色团。通过比较这些不同构建体的光学特性，可以揭示双发色团系统中是否存在协同效应。研究主要采用了以下几种关键技术方法：光谱学分析（包括吸收光谱和圆二色光谱Circular Dichroism）用于检测发色团间的电子相互作用；时间分辨荧光测量用于评估荧光寿命的变化；以及最为关键的单光子计数和光子反聚束(photon antibunching)实验，这是判断发射体是作为多个独立单元还是单个量子单元发光的金标准。此外，研究涉及了多种进化上 divergent 的荧光蛋白，以检验激子耦合是否具有普适性。研究队列来源于工程化的蛋白质样本，而非临床或动物样本。

研究结果

FP串联二聚体表现出支持激子耦合的光物理特性

研究人员首先构建了来自不同进化分支的荧光蛋白串联二聚体(Tandem Dimers, TDs)，即两个完整的荧光蛋白通过短肽链连接在一起，从而每个TD含有两个发色团。与只含有一个发色团的单体构建体相比，这些TDs在吸收光谱上表现出红移（即吸收峰向长波长方向移动）。更重要的是，在圆二色光谱中观察到了典型的Davydov分裂现象，这是激子耦合存在的一个强有力的光谱学证据。此外，时间分辨荧光测量显示，TDs的荧光寿命显著短于其对应的单体。这些吸收红移、Davydov分裂和荧光寿命缩短的现象，共同指向了在含有两个发色团的FP-TDs中存在着激子耦合。

光子反聚束统计证实串联二聚体作为单一量子单元发光

为了进一步验证激子耦合的本质，研究团队进行了光子统计实验。如果两个发色团是独立发光的，它们会表现出类似经典光源的光子发射统计（聚束效应）。然而，实验结果显示，含有两个发色团的TDs表现出了明显的亚泊松统计(Sub-Poissonian statistics)和光子反聚束(photon antibunching)现象。这种行为是单量子发射体的特征，表明尽管存在两个物理上的发色团，但整个TD系统在光学上表现为一个单一的、量子相干的发射实体。这直接证明了激子离域的存在，即激发能量在两个发色团之间共享，而不是局域在其中一个上。

激子耦合的有效距离远超FRET极限

一个关键的发现是关于激子耦合发生的距离范围。众所周知，F?rster共振能量转移(F?rster Resonance Energy Transfer, FRET)是生物分子中短距离能量转移的常见机制，其有效范围通常在1-10纳米。本研究通过设计具有不同发色团间距的TDs（通过调整连接肽的长度实现）来测试激子耦合的距离依赖性。令人惊讶的是，即使在Venus荧光蛋白变体的发色团间距达到20纳米时，仍然观察到了表明激子耦合的光子反聚束统计。这个距离是传统FRET理论有效距离上限（约10纳米）的两倍。然而，当发色团间距进一步增大到60纳米时，这种量子特性就消失了。这一结果表明，荧光蛋白中的激子耦合可以在远超FRET极限的距离上发生，但其作用范围并非无限。

研究结论与意义

本研究通过综合的光谱学和量子光学方法，提供了令人信服的证据，表明在进化上多样的荧光蛋白串联二聚体中存在激子耦合和激子离域。研究结论可归纳为：1）激子耦合是多种β-桶状结构荧光蛋白中存在的普遍现象，而非个别蛋白的特例；2）这种耦合导致双发色团系统表现出单一量子发射体的特性；3）激子耦合在荧光蛋白中作用的有效距离可以延伸至20纳米，远超FRET的经典极限，但存在距离上限（在本研究中，60纳米时失效）。

这项研究的意义重大。首先，它提醒广大使用荧光蛋白生物传感器的科研人员，在解释涉及紧密相邻或串联排列的荧光蛋白的实验数据（如荧光寿命成像FLIM、荧光强度或光谱变化）时，需要将激子耦合的可能性纳入考量，以避免对分子间相互作用或构象变化做出错误的推断。这对于确保生物传感数据的准确性至关重要。其次，该研究揭示了保守的β-桶状结构是促成这一长距离激子离域现象的共同结构基础。这一发现为蛋白质工程开辟了新的方向。科学家们现在可以有目的地利用这种天然的结构平台，来设计和开发新型的遗传编码激子材料，这些材料可能在量子信息处理、生物光子器件和超分辨率成像等领域具有潜在的应用价值。总之，这项工作不仅深化了我们对荧光蛋白基本光物理过程的理解，也为生物技术和纳米生物材料的未来发展提供了重要的理论依据和设计原则。