荧光蛋白中激子耦合诱导的反常光物理现象研究

《Biophysical Journal》：Anomalous photophysical behaviors attributed to excitonic coupling in fluorescent proteins.

本研究针对荧光蛋白(FP)中激子耦合现象的系统性验证需求，通过构建单/双发色团串联二聚体(TD)，发现其存在吸收红移、圆二色性Davydov分裂及荧光寿命缩短等激子耦合特征。光子反聚束实验证实双发色团TD可作为单一量子单元发光，激子耦合作用距离可达20 nm（远超FRET极限）。该发现为生物传感器设计提供了关键理论依据，并推动了基因编码激子材料的发展。

　　

在生命科学研究的工具箱里，荧光蛋白（Fluorescent Proteins, FPs）无疑是一颗璀璨的明星。从最初在美丽水母中发现的绿色荧光蛋白（GFP）到如今成百上千种基因编码的生物传感器，这些能够自身发光的蛋白质使得科学家能够在活细胞中实时“观看”生命过程的动态变化，例如追踪特定蛋白质的定位、监测细胞内钙离子浓度的波动等。然而，在这些广泛应用背后，荧光蛋白自身的光物理行为却隐藏着一些尚未被完全理解的奥秘。此前已有研究观察到一些反常的光物理现象，例如荧光寿命和光谱的异常变化，这些现象被认为可能与激子耦合（exciton coupling）有关。所谓激子耦合，是一种量子力学现象，指的是当两个或多个发色团（chromophore，即吸收光并可能发射光的分子部分）在空间上足够接近且排列适当时，它们可以共享一个被激发的电子态，形成一种离域的激发态（delocalized excitation）。这种耦合效应有可能在远距离上改变荧光蛋白的光学性质，这对于依赖荧光强度、寿命或光谱变化来进行定量测量的生物传感器实验而言，其影响至关重要，若被忽视，可能导致实验数据的误读。

尽管有迹象表明激子耦合的存在，但几个关键问题依然悬而未决：这种耦合现象是否是所有具有保守β-桶状结构（β-barrel）的荧光蛋白所共有的特性？荧光蛋白中发生激子耦合所需的发色团之间的距离极限是多少？它是否超越了经典的福斯特共振能量转移（F?rster Resonance Energy Transfer, FRET）理论所规定的距离范围（通常为1-10纳米）？为了解答这些疑问，由Tuan Nguyen、Steven S. Vogel等研究人员组成的研究团队在《Biophysical Journal》上发表了一项深入研究。他们的研究结果表明，荧光蛋白中确实存在显著的激子耦合，其作用距离远超FRET极限，并且这种特性与荧光蛋白保守的β-桶状结构密切相关。这一发现不仅深化了我们对荧光蛋白光物理基础的理解，也对未来设计更精准的生物传感器和开发新型基因编码的激子材料具有重要的指导意义。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了几项关键技术：他们首先通过基因工程手段构建了包含一个或两个功能性发色团的荧光蛋白串联二聚体（Tandem Dimers, TDs）作为研究模型。在光谱学分析方面，采用了紫外-可见吸收光谱和圆二色性（Circular Dichroism, CD）光谱来探测发色团间的相互作用。荧光寿命通过时间相关单光子计数（Time-Correlated Single Photon Counting, TCSPC）技术进行测量。最为关键的是，研究人员利用光子反聚束（Photon Antibunching）实验，结合汉伯里-布朗和特维斯（Hanbury-Brown and Twiss, HBT）干涉仪 setup，来验证双发色团系统是否作为一个单一的量子发光体行为。

研究结果

工程化FP串联二聚体表现出激子耦合的光谱特征

研究人员设计并制备了来自不同进化分支的荧光蛋白串联二聚体（TDs），这些二聚体包含两个相邻的发色团。通过吸收光谱分析，他们发现与单个发色团的FP或物理混合的FP相比，这些TDs的吸收光谱发生了红移。同时，圆二色性（CD）光谱显示出明显的Davydov分裂（Davydov splitting）特征，这是发色团间存在电子耦合形成激子的典型标志。这些光谱学的变化强有力地支持了在FP的串联二聚体中存在激子耦合。

激子耦合导致荧光寿命缩短

为了进一步验证激子耦合对荧光动力学的影响，研究人员测量了各种FP-TDs的荧光寿命。结果显示，与相应的单体FP相比，所有具有两个发色团的TDs都表现出更短的荧光寿命。这种寿命的缩短与激子耦合导致激发态衰变通道增加的理论预期相一致，从而从动力学角度为激子耦合的存在提供了证据。

光子反聚束证实双发色团TD作为单一量子单元发光

为了最终确认激子耦合导致的量子态离域，研究团队进行了光子反聚束实验。该实验是判断一个发光体是单光子源（单一量子体系）还是多光子源（独立发光体）的金标准。实验结果表明，尽管TDs含有两个发色团，但它们表现出显著的光子反聚束效应，即g⁽²⁾(0)值远小于0.5。这意味着双发色团TD在发光时是作为一个整体的、单一的量子发光单元（single quantum unit）行为的，其激发态是离域的，而不是两个独立的发色团先后发光。这一发现直接证明了激子耦合的量子本质。

激子耦合的作用距离远超FRET极限

一个突破性的发现是关于激子耦合的作用距离。研究人员构建了具有不同发色团间距（通过柔性连接肽调控）的Venus荧光蛋白TDs。令人惊讶的是，即使在发色团中心间距达到20纳米时，仍然观察到了明显的亚泊松分布（Sub-Poissonian）的光子统计特性（即光子反聚束），这表明激子耦合在如此远的距离上依然有效。20纳米的距离是传统FRET理论作用距离上限（约10纳米）的两倍。然而，当发色团间距增大到60纳米时，这种量子特性就消失了。这表明荧光蛋白中的激子耦合具有显著的长程特性，但其有效性仍存在一个距离阈值。

研究结论与意义

本研究通过多方面的实验证据，确证了在进化上 divergent 的荧光蛋白串联二聚体中存在激子耦合现象。吸收红移、CD光谱Davydov分裂、荧光寿命缩短以及最关键的光子反聚束实验，共同构成了支持激子耦合存在的完整证据链。研究不仅证实了这种现象的存在，更重要的是揭示了其长程特性——作用距离可达20纳米，远超FRET极限。

讨论部分指出，这一发现具有多重重要意义。首先，它提示我们在使用荧光蛋白构建生物传感器（尤其是基于FRET的传感器）或进行定量荧光测量（如荧光寿命成像FLIM）时，必须考虑激子耦合可能带来的影响，以避免对数据（如表观FRET效率）的错误解读。其次，研究结果支持了提出的假设：荧光蛋白保守的β-桶状结构是允许其发色团在生理条件下实现激子离域的共同结构基础。这种刚性且保护性的蛋白环境，可能为发色团提供了适宜的方向和距离，从而促进了长程激子耦合的形成。最后，这项研究为开发新型的“基因编码激子材料”（genetically encoded excitonic materials）打开了大门。这意味着未来有可能通过基因工程手段，在活细胞内直接编程构建具有特定量子光学特性的纳米结构，用于量子生物学研究、生物传感或新型生物光子器件的开发。总之，该工作将荧光蛋白的研究从经典的荧光标记工具推向了量子光物理的前沿领域，标志着我们对这些强大生物分子工具的理解进入了一个新的阶段。