综述：细菌重组蛋白生产的进展：异源系统中的策略与挑战

《Current Research in Biotechnology》：Advancing recombinant protein production by bacteria: strategies and challenges in heterologous systems

本综述系统阐述了细菌异源系统重组蛋白生产的最新策略与挑战，重点探讨了以大肠杆菌（E. coli）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）等为代表的微生物宿主，及其Sec、Tat和ABC转运蛋白等分泌途径。文章深入分析了从启动子优化、密码子适应到信号肽工程、菌株改良及蛋白质融合技术等多种分子策略，旨在提高分泌效率和产物产量，并展望了合成生物学与分泌工程结合的应用前景。

　　

摘要

重组蛋白在细菌系统中的生产是工业生物技术的核心，为治疗性蛋白质和酶的可扩展、成本效益高且高效的合成提供了可能。本综述聚焦于细胞外异源蛋白生产，探讨了包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和Brevibacillus choshinensis在内的关键细菌宿主。文中重点讨论了跨膜蛋白输出的分泌途径，如Sec途径、双精氨酸转运（Tat）途径和ATP结合盒（ABC）转运系统。从启动子优化、密码子适应到信号肽工程、菌株修饰以及蛋白质融合技术等多种分子策略被强调，这些策略有助于提高分泌效率和产物产量。综述比较了革兰氏阳性和革兰氏阴性系统，并结合案例研究，分析了针对不同宿主和蛋白质定制方法的重要性。文章进一步讨论了基于CRISPR/Cas9n的遗传干预日益增长的相关性，以及微生物生理学在促进优化蛋白质折叠和运输中的作用。总体而言，合成生物学、分泌工程和宿主优化的整合为推进高价值重组蛋白的细胞外生产提供了有前景的途径。

引言

重组蛋白表达已通过多个平台得到广泛探索，使用的宿主生物多种多样，如动物、植物、昆虫、真菌和细菌。其中，细菌表达系统因其众多优势而脱颖而出，包括繁殖迅速、培养简单和遗传操作简便。细菌宿主根据其生理特征分为革兰氏阴性和革兰氏阳性。大肠杆菌作为一种革兰氏阴性物种，由于其广泛研究的遗传背景、复杂的遗传工程工具以及快速达到高细胞密度的能力，常被用作蛋白质表达的宿主，从而实现目标蛋白质的大规模生产。然而，在大肠杆菌表达系统中遇到的困难促使人们研究替代方案。

各种革兰氏阳性细菌，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、短芽孢杆菌、乳酸乳球菌和植物乳杆菌，已被有效地用于开发蛋白质表达系统。这些系统提供了具有独特优势的替代平台，增加了重组蛋白生产的选择范围。科学文献和异源重组蛋白的商业目录都承认Brevibacillus作为宿主系统的重要性。这个革兰氏阳性细菌属在各种环境栖息地中大量存在。Brevibacillus的特定菌株表现出显著的特征，如快速生长、通过电穿孔实现高效转化、获得穿梭载体、细胞外蛋白酶产量极少以及异源蛋白的稳定表达，使其在实验室环境中成为有价值的模型。

尽管取得了这些进展，但近年来，人们重新关注克服细菌异源表达系统中的持续瓶颈，尤其是在大肠杆菌中。例如，有研究总结了旨在实现可溶性重组蛋白产量的最新创新，包括改进的糖基化途径、增强的二硫键形成、受控的聚集（甚至利用包涵体形成）以及无抗生素质粒选择系统。这些方法解决了诸如错误折叠、不溶性、表达蛋白质的毒性以及与抗生素使用相关的监管或成本问题等限制。

另一篇近期综述强调了功能性肽或融合标签在促进原核和真核系统中蛋白质表达、溶解度、纯化和下游应用中的重要性。此外，对表达载体、菌株工程、mRNA稳定性和翻译控制的调节、分泌途径和应激反应管理的研究最近势头强劲。然而，许多挑战仍然存在，包括：（i）在细菌宿主中实现正确的翻译后修饰（例如，糖基化、二硫键形成）；（ii）高表达水平带来的代谢负担；（iii）包涵体的形成及其（不）溶性；（iv）监管限制，如抗生素抗性标记；（v）从实验室到工业过程的可扩展性；以及（vi）表达蛋白质的质量（折叠、功能性）。

本综述旨在汇集最新策略，以增强细菌系统，特别是异源宿主中重组蛋白的产量和功能性，并分析剩余的障碍。总结了革兰氏阴性和革兰氏阳性系统、工程菌株和表达载体、融合/标签策略和分泌系统。还讨论了促进蛋白质从细胞内运输到细胞外环境的详细途径，从而导致滴度值增加。

细胞外异源蛋白生产

通过异源系统进行细胞外蛋白生产利用基因工程生物（如真菌、酵母和细菌）来高效生产蛋白质。该策略提供了可扩展性、成本效益以及为特定应用定制蛋白质的能力。这些系统拥有完善的遗传工具和强大的分泌途径，简化了下游加工。这使得能够生产复杂蛋白质，这在天然宿主中不易实现。遗传工程和合成生物学的进一步进步允许对生产过程进行精确控制。异源系统在产生生物燃料生产、食品加工和生物修复中至关重要的酶方面发挥着关键作用，彻底改变了工业过程，以提高效率和可持续性。然而，在实现广泛的细胞外蛋白分泌方面仍然存在挑战，许多蛋白质尚未通过这种方法有效生产。因此，需要根据具体情况优化不同蛋白质和生物体的蛋白质分泌途径。

一些研究利用各种策略和产量已呈现在表中，展示了细菌宿主在重组蛋白生产中的多功能性。该汇编提供了跨不同细菌宿主的重组蛋白表达的全面概述，反映了这些系统在生产治疗性蛋白质和工业酶方面的多功能性和性能。值得注意的是，大肠杆菌仍然是最广泛使用的宿主，对于干扰素-α（20 g/L）、抗体片段（10 g/L）、胰岛素（5 g/L）以及工业酶如β-半乳糖苷酶（8 g/L）等蛋白质实现了显著的高产量。芽孢杆菌物种，特别是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和B. choshinensis，显示出作为分泌高效平台的强大潜力，据报道，α-淀粉酶（高达17,925.6 U/mL）、β-甘露聚糖酶（6041 U/mL）、角蛋白酶（9813.2 U/mg）和支链淀粉酶（1005.8 U/mL）的酶活性水平很高。其他宿主，包括Brevibacillus、谷氨酸棒杆菌和S. lividans，有助于利基应用，如角质酶、荧光蛋白和抗菌肽。产量范围从毫克到每升数十克，或从低到异常高的酶活性，说明了细菌平台的适应性，其中宿主选择、遗传优化和表达策略是根据目标蛋白质量身定制的。

蛋白质输出途径在微生物中的作用

途径是控制异源系统中细胞外蛋白质生产的复杂系列生化反应和分子相互作用。这些途径包括从转录和翻译到蛋白质折叠、翻译后修饰和分泌的一系列过程。细胞外蛋白质生产始于转录，DNA通过RNA聚合酶转录成mRNA。mRNA将遗传信息携带到核糖体进行翻译，在那里它被转化为多肽链的氨基酸。这些过程的效率直接影响蛋白质生产速率以及产量。翻译后，多肽链折叠成其天然结构，这对稳定性、功能和分泌至关重要。伴侣蛋白有助于正确折叠，确保正确的构象。翻译后修饰如糖基化和磷酸化会改变蛋白质的结构和功能，影响稳定性、活性和定位。细胞质中加工后，细胞外蛋白质的运输由分泌途径介导。

蛋白质输出途径是微生物发病机制不可或缺的一部分，促进毒力因子的分泌，这些因子操纵宿主细胞过程并逃避免疫反应。例如，细菌病原体利用T3SS将效应蛋白直接注入宿主细胞，从而实现定植和感染的建立。了解病原体中蛋白质分泌的潜在机制为宿主-病原体相互作用提供了见解，并为抗菌策略的开发提供了信息。它们还依赖蛋白质输出途径来适应不同的环境条件和生态位。例如，极端微生物利用专门的蛋白质输出系统来分泌参与极端环境中复杂底物降解的酶。Tat途径和Sec途径通常用于在微生物宿主中分泌异源蛋白质，促进工业酶、生物基材料和治疗性蛋白质的生产。了解运输途径有助于识别瓶颈并消除它们以获得更好的生产。

用于细胞外蛋白质生产的微生物主力

蛋白质在细菌中主要通过三种途径分泌，即一般分泌（Sec）途径、双精氨酸转运（Tat）途径和ATP结合盒（ABC）转运蛋白途径。未折叠或部分折叠的蛋白质跨膜运输由Sec途径介导，并借助SecYEG易位子复合物。相反，Tat途径负责运输完全折叠的蛋白质跨膜。在真核生物如酵母和丝状真菌中，蛋白质通过内质网和高尔基体分泌。ER是蛋白质折叠和PTM的场所，而高尔基体包装和运输蛋白质以进行分泌。

大肠杆菌由于其易用性和快速生长而长期以来一直是蛋白质表达的主要选择。然而，诸如蛋白水解降解和包涵体形成等挑战阻碍了其用于细胞外蛋白质生产的功效。菌株工程、分泌信号和伴侣蛋白共表达的最新创新已显著解决了这些问题，从而提高了细胞外蛋白质产量。类似地，枯草芽孢杆菌以其强大的分泌机制而闻名，为细胞外蛋白质生产提供了一个有吸引力的替代方案，并有商业工具包可用于细胞外基因表达。各种研究证明了其以克级数量生产酶的潜力。

Brevibacillus物种由于能够产生具有若干有益特性的细胞外蛋白质而引起了生物技术领域的兴趣。有研究探索了来自鸡蛋的苦味减少特性的重组核黄素结合蛋白（rRBP）的微生物生产。他们设计了一个鸡RBP基因表达载体，该载体被插入到一个大肠杆菌-Brevibacillus穿梭载体中。这种方法使得能够在B. choshinensis HPD31中成功生产可溶的、未糖基化的rRBP，在培养上清液中达到0.8 g/L的产量。尽管表达的RBP表现出部分二聚化，但使用色谱技术分离了单体RBP。尽管其核黄素结合能力降低，但纯化的rRBP减少了咖啡因和奎宁的苦味。这项研究强调了Brevibacillus系统表达RBP抑制剂的潜力。

信号肽

信号肽是短的氨基酸序列，指导新合成的蛋白质到达其细胞目的地，通常是分泌到细胞外空间或膜插入。它们与细胞机制（如信号识别颗粒）相互作用，将核糖体-新生链复合物引导至相关膜。将目的基因与信号肽序列融合，确保它们在N末端带有信号肽的合成。一旦表达，产生的mRNA被翻译成带有信号肽的蛋白质，将其引导至适当的细胞区室进行加工。这种广泛使用的方法跨越细菌、酵母和哺乳动物细胞，促进了重组蛋白的有效分泌，简化了下游加工和纯化。针对特定宿主生物优化信号肽序列可以显著提高分泌效率。这种优化可以涉及使用不同的信号肽或通过诱变修饰现有的信号肽。

信号肽的选择和工程在指导蛋白质通过分泌途径方面仍然至关重要。研究一致报告，异源或合成信号肽在跨物种表达系统中对于最佳分泌比天然信号肽更有效。在枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌中，使用合成信号肽（例如，cgR_2070）导致分泌效率显著提高。高通量筛选和机器学习引导的信号设计已成为定制信号肽的有前景的方法。表2总结了常用的天然和合成信号肽，这些信号肽促进了跨微生物宿主的重组蛋白分泌。像枯草芽孢杆菌中的AmyE和大肠杆菌中的PelB这样的经典肽仍然被广泛应用，尽管通常效率中等。较新的策略，如Tat途径信号（TorA, GlmU）能够分泌正确折叠的蛋白质。进展还包括合成和机器学习引导的信号肽，这些信号肽增强了宿主如棒状杆菌和芽孢杆菌中的异源蛋白输出。总体而言，这些发展突显了从传统的天然信号到工程系统的演变，这些系统显著提高了多种工业和治疗性蛋白质的分泌效率。

工程化分泌途径组件

启动子在调节基因表达中至关重要，尤其是在异源系统中生产细胞外蛋白质时。强启动子驱动高转录水平，促进mRNA生产以及随后的蛋白质表达，从而导致细胞外蛋白质产量提高。诱导型启动子提供对基因表达的精确控制，响应特定线索或刺激。使用诱导型启动子微调蛋白质表达可以优化生产参数，如生长培养基和温度，从而提高蛋白质产量、质量和折叠效率。表3概述了细菌宿主中用于重组蛋白表达的常用启动子，突出了它们的调控灵活性和应用。强组成型启动子如枯草芽孢杆菌中的P43适用于连续酶生产，而诱导型系统如Ptac、Pbad、T7和PxylA允许受控表达，这对于有毒或复杂蛋白质至关重要。混合启动子如Pgrac结合了强度和可调性，为工业规模生产提供了优势。总体而言，启动子的选择能够微调表达水平，以在各种应用中平衡产量、蛋白质质量和宿主生存能力。

异源系统中细胞外蛋白质生产的策略

细菌中由遗传、分子和过程工程策略组合驱动的细胞外蛋白质生产一直是工业生物技术的基石。该过程的核心是选择强启动子和诱导型启动子，它们调节基因表达并实现高水平、可调谐的蛋白质合成。密码子优化通过使异源基因与宿主密码子使用偏好匹配来进一步提高翻译效率。选择强启动子和诱导型启动子通过最大化表达水平、提供精确控制以及实现定制生产策略同时最小化宿主菌株负担来增强细胞外蛋白质生产。

靶向过表达或修饰Sec、Tat或ABC转运途径的组件日益被采用。例如，在大肠杆菌中，过表达TatABC操纵子使得能够高水平分泌hGH和IFN-α2b。通过过表达SecYEG、SecA和YidC来增强Sec机制，缓解了限制并提高了挑战性蛋白质的周质产量。在地衣芽孢杆菌中工程化多拷贝Tat基因簇，有助于改善大型寡聚酶的分泌。

细胞内蛋白质折叠质量直接影响易位功效。已采用胞质伴侣蛋白如DnaK、DnaJ、GroEL和触发因子的共表达来在分泌前增强正确折叠。在枯草芽孢杆菌中，将易位后伴侣蛋白如PrsA与胞质系统结合显著提高了分泌水平（例如，AmyS >2000 U/mL）。在Brevibacillus系统中共表达prsA、prsC、prsQ和敲除细胞外蛋白酶（bcp）显著提高了α-淀粉酶产量。表5提供了用于改善重组蛋白生产的融合和共表达策略。载体蛋白和信号肽增强溶解度、折叠和分泌，而纯化标签简化回收。伴侣蛋白共表达支持正确折叠，系统特异性修饰，如PrsA共表达或蛋白酶敲除，进一步提高了产量和稳定性。

除了遗传因素外，培养参数如pH、温度、通气、诱导剂和补料策略也在分泌效率中发挥重要作用。优化的补料分批和高细胞密度发酵系统对于将遗传收益转化为可扩展生产至关重要。菌株特异性发酵方案（例如，B. choshinensis、谷氨酸棒杆菌和枯草芽孢杆菌）已使蛋白质生产达到克级滴度。

高效的下游加工对于收获和纯化由工程宿主生物产生的细胞外蛋白质至关重要。该过程通常涉及一系列下游步骤，包括收获培养液、细胞去除和目标蛋白质的纯化。优化下游加工技术，如过滤、离心和色谱法，对于最大化产品回收率和纯度至关重要。色谱技术，如亲和、离子交换、尺寸排阻和疏水相互作用色谱，基于理化性质进行蛋白质纯化。优化涉及选择适当的树脂、缓冲液和洗脱策略以实现高纯度和回收率，同时优化流速和柱填充密度提高了通量并最小化了加工时间。表7阐述了发酵和下游优化的各种策略。这些包括用于改善细胞外重组蛋白质生产和回收的策略。它涵盖了有助于提高研究和工业生物制造应用的产量、纯度和效率的关键培养条件、发酵方法和纯化步骤。

蛋白质工程包括合理设计或定向进化方法，以增强目标蛋白质的分泌特性、稳定性和溶解度，从而改善其在异源系统中的细胞外生产。合理设计涉及基于结构见解和生化原理策略性地修改蛋白质的氨基酸序列以优化其特性。这可能包括引入突变以增强分泌信号、改善折叠效率或增加对蛋白水解降解的抗性。另一方面，定向进化利用迭代的诱变和选择轮次来产生具有所需性状的蛋白质变体。蛋白质工程策略使得能够定制目标蛋白质以适应特定的生产要求，从而在异源表达系统中提高产量和质量。表8列举了各种蛋白质分泌策略以增强生产。

细菌中的蛋白质分泌途径

蛋白质输出途径对细菌至关重要，包括Sec依赖性途径、Tat途径和ABC转运蛋白。Sec依赖性途径通过SecYEG复合物运输未折叠蛋白质，信号肽指导分泌。相比之下，Tat途径使用Tat machinery输出折叠蛋白质，识别双精氨酸 motif。这两种途径对于输出参与细胞壁合成、酶生产和毒力的蛋白质都至关重要。ABC转运蛋白，通过ATP水解提供动力，促进各种底物的输出，包括蛋白质、离子和脂质。一些ABC转运蛋白直接或间接地有助于蛋白质输出，对营养吸收和抗生素耐药性至关重要。了解这些途径阐明了细菌适应不同环境的能力，并有助于酶生产和益生菌开发等生物技术应用。

Sec途径

Sec途径，也称为分泌途径，是细菌细胞中用于将蛋白质从细胞质输出到细胞包膜或细胞外空间的关键机制。该过程涉及各种细胞质和膜蛋白（外周和整合）以及脂质之间的复杂相互作用。该途径涉及一组细胞质和膜蛋白，它们共同促进蛋白质易位。该途径主要以其未折叠状态易位蛋白质，使用ATP水解和质子梯度作为能量。它由几个组件组成，包括SecYEG易位酶、SecA运动蛋白和各种伴侣蛋白，如SecB和SecDF。SecA，一种运动蛋白，在将前蛋白递送至膜通道SecYEG进行易位方面起着至关重要的作用。SecYEG易位酶是一种膜嵌入的异源三聚体，形成蛋白质传导孔。SecA是一种多功能蛋白，将蛋白质引导至SecYEG通道，并作为为蛋白质易位提供能量的ATP酶。SecB是一种伴侣蛋白，与预分泌蛋白结合并防止其折叠，将其底物递送至SecA。SecDF是一种质子驱动的蛋白质输出运动蛋白，参与易位的后期阶段。该途径以两种主要方式工作：共翻译和翻译后。共翻译易位涉及SRP-新生链复合物将核糖体靶向易位酶，而翻译后易位涉及SecB-新生链复合物与SecA的相互作用。然后SecYEG易位酶结合到SecA-SecB复合物，蛋白质以未折叠状态跨膜易位。值得注意的是，一些革兰氏阳性细菌拥有两个SecA同源物，SecA1和SecA2。SecA1在通过典型Sec途径的蛋白质分泌中起关键作用，而SecA2在标准实验室条件下很少需要生长。Sec途径是一种高度保守的机制，存在于所有生命领域，包括真核生物、古菌和真细菌。在真核生物中，该途径参与将蛋白质从内质网输出到高尔基体和分泌途径。

信号肽的选择极大地影响了大肠杆菌中的分泌成功。例如，在枯草芽孢杆菌中表达的几丁质酶，使用大肠杆菌OmpA信号肽导致比天然枯草芽孢杆菌信号高得多的产量。这突显了需要筛选或工程化Sec信号以获得与宿主Sec machinery的最佳兼容性。此外，平衡表达水平与Sec易位子能力至关重要。分泌靶标的过量生产会使Sec途径饱和，导致应激或错误加工。研究表明，可调谐表达系统可以最大化周质产量而不会使易位子超载。值得注意的是，大肠杆菌可以通过上调Sec途径组件（SecA, LepB）和辅助因子（YidC）来适应高分泌负荷，达到一定限度，从而暂时增加其分泌能力。这种适应性反应，加上适当的信号肽和表达控制，使得能够在周质中生产每升多毫克的正确折叠的hGH。

枯草芽孢杆菌天然擅长以非常高的水平（克级数量）分泌其自身的酶（同源蛋白质）。然而，异源蛋白质通常以低得多的滴度分泌，这是由于在各个阶段（如蛋白质折叠、易位、加工或降解）存在瓶颈。双淀粉酶案例研究说明了这些挑战和解决方案。AmyL和AmyS，来自不同芽孢杆菌的两种淀粉酶，都通过枯草芽孢杆菌中的Sec路线输出，但它们的初始产量不同，反映了蛋白质特异性的瓶颈。研究人员发现，增强Sec途径受到PrsA伴侣蛋白表达较低的限制，而prsA的额外拷贝大大提高了分泌效率3-5倍。此外，胞质伴侣蛋白（DnaK-GrpE-DnaJ系统）的共表达与PrsA协同改善了输出过程中的蛋白质折叠，导致分泌酶活性增加高达10-12倍。这种组合方法最终使得AmyS在发酵罐中的产量>2000 U/mL，这一水平接近工业相关性。鉴于有时在芽孢杆菌中遇到的局限性，正在探索其他革兰氏阳性宿主。例如，谷氨酸棒杆菌具有单层膜，并且通常被认为是安全的，使其对分泌生产具有吸引力。AmyE淀粉酶案例表明，当配备强启动子和优化的Sec信号肽时，谷氨酸棒杆菌确实可以将外源酶完全分泌到细胞外。值得注意的是，在系统中使用合成信号序列（cgR_2070）是有效易位的关键，表明信号肽工程是改善跨物种Sec介导分泌的普遍主题。

链霉菌物种，配备了强大且进化完善的分泌系统，用于细胞外酶生产，代表了异源蛋白质表达的有前景的宿主。这些放线菌已证明能够分泌多种功能性蛋白质，包括工业酶和药物蛋白质，并保持其活性形式。一项开创性研究通过表明当与细菌信号肽融合时，链霉菌lividans可以分泌人白细胞介素-2（IL-2），从而确立了该平台的可行性。尽管IL-2具有生物活性并成功输出，但其生产受到低产量和未加工中间体积累的阻碍，表明Sec易位 machinery可能存在局限性，可能是由于折叠效率低下或加工组件饱和。相比之下，通过工程化合成信号肽（LSSP）并使用强启动子来增强表达，证明了一种更有效的分泌策略。这种方法导致分泌了约8 mg/L的复杂的、易于寡聚化的整合素结构域。值得注意的是，分泌的蛋白质保持了能够结合中和抗体的构象表位，表明正确折叠和功能呈现。这些发现强调，通过优化的Sec靶向序列和表达参数，S. lividans可以高效生产和分泌甚至结构复杂的真核蛋白质结构域。

跨这些案例研究，出现了几个共同主题：（i）信号肽选择（或工程化）通常是异源蛋白质Sec介导分泌的成败因素；（ii）Sec途径的能力（SecYEG易位子、SecA运动蛋白、伴侣蛋白如SecDF、YidC、PrsA等）在高表达分泌蛋白时可能变得有限，因此增强这些组件或调节翻译速率可以缓解瓶颈；以及（iii）即使传统的“困难”蛋白质（二硫键连接的激素、膜蛋白结构域、哺乳动物细胞因子）也可以以活性形式分泌，如果表达系统被调整以适应宿主Sec途径能力。这些来自大肠杆菌、芽孢杆菌、棒状杆菌和链霉菌的例子强调了Sec分泌途径对于多样化应用的通用性，同时指导了工程策略（信号序列优化、宿主途径增强）以最大化细菌系统中异源蛋白质的产量。

双精氨酸转运（Tat）途径

Tat途径是一种在细菌、古菌和植物中发现的至关重要的蛋白质输出系统。与运输未折叠蛋白质的Sec途径不同，Tat途径促进折叠蛋白质跨能量转换膜的易位。该途径在某些细菌的毒力中起重要作用，并参与运输含有氧化还原辅因子或金属离子的蛋白质。该途径选择性运输折叠蛋白质，通过防止错误折叠蛋白质输出确保高保真度。总体而言，Tat途径有效地跨膜运输蛋白质，对细胞功能和致病性至关重要。Tat易位酶由三种功能不同的膜蛋白组成：TatA、TatB和TatC。TatB和TatC在利用双精氨酸信号序列跨内/细胞质膜蛋白质易位中发挥特定作用。

Tat途径依赖于TatA、TatB和TatC之间的协调相互作用来识别和易位折叠蛋白质。TatB和TatC形成一个稳定的受体复合物，通过其N末端双精氨酸信号肽特异性识别底物。在信号肽结合后，底物深入参与TatBC复合物内部，启动运输过程。TatA随后被招募到复合物中，在那里它从TatC取代TatB，促进底物接合，并组装成形成易位孔的寡聚结构。TatA动态聚合对于形成能够容纳完全折叠货物的蛋白质传导通道至关重要。TatB与TatC合作，在信号肽识别和底物选择的早期阶段起核心作用。TatC作为一个中心枢纽，与TatB和TatA相互作用，以协调易位酶的逐步组装，并确保精确的信号序列识别、货物招募和跨膜易位。机制已在图2中演示，其中蛋白质在4个阶段被输出到细胞外环境。

Tat途径运输完全折叠的蛋白质跨细菌细胞质膜，使其成为分泌复杂或含辅因子的重组蛋白质的有吸引力的路线，这些蛋白质与Sec不兼容。表10列举了使用Tat靶向信号肽在各种细菌宿主中表达和分泌异源蛋白质的例子，应用范围从工业酶生产到治疗性蛋白质制造和实验室研究。该表总结了通过Tat系统重组蛋白表达的选择例子，突出了细菌宿主、表达的异源蛋白质、使用的Tat信号肽和相关参考文献。这些研究证明了Tat途径跨多种蛋白质类型和宿主的适用性，特别是用于折叠蛋白质的分泌。

Tat途径已成为细菌中异源蛋白质表达的一种有价值的替代Sec分泌系统，因为它具有输出完全折叠蛋白质的独特能力。这一特性使得能够生产和分泌复杂蛋白质，如多聚酶、辅因子结合蛋白质和二硫键连接的生物药物，这些与Sec介导的易位不兼容。多种细菌宿主，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、S. lividans、地衣芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌，已被成功工程化或适应以利用Tat途径进行异源蛋白质的分泌表达。

应用跨越多个领域：在大肠杆菌中生产治疗性蛋白质，如人生长激素和干扰素-α2b；在革兰氏阳性宿主中分泌工业酶，如植酸酶、肌氨酸氧化酶和转谷氨酰胺酶；以及跨各种系统表达报告基因和功能性蛋白质，如GFP和抗体片段。已采用几种策略来增强Tat依赖性分泌，包括信号肽优化、Tat易位酶组分的过表达，以及使用蛋白酶缺陷型或分泌优化的宿主菌株。

大肠杆菌已被广泛探索作为Tat依赖性分泌的宿主，特别是为了在周质中获得正确折叠的、具有二硫键的蛋白质以便于纯化。大多数实现使用N末端Tat信号肽（如大肠杆菌TorA信号）将蛋白质引导至天然TatABC易位子。关键例子包括生产绿色荧光蛋白（GFP）、人生长激素（hGH）、干扰素-α2b和抗体片段、人Activin A（TGF-β家族二聚体）和用于生物催化的酶。

GFP是第一个被证明通过TAT途径进行周质输出的蛋白质，此后各种研究证明发酵条件和共表达都可以提高表达产量。人生长激素（191个氨基酸，2个二硫键）已在大肠杆菌中生产，带有N末端Tat信号以实现周质易位。因为Tat输出折叠蛋白质，hGH可以在周质中氧化折叠（允许天然二硫键形成）。为了克服Tat的低基础通量以达到商业产量，大肠杆菌的TatExpress菌株被工程化，在TatABCD操纵子上游有一个强诱导型启动子（Ptac）。产量在摇瓶中达到>30 mg/L的周质hGH，分泌的hGH占野生型细胞获得量的>5倍。输出的激素被加工成成熟的22 kDa形式，并在周质中积累而没有裂解。进一步的融合蛋白实验已生产出人生长激素从周质到细胞外培养基，产量达到0.35 g/L水平。

研究表明，其他Sec不兼容且具有医学相关性的蛋白质可以在大肠杆菌中通过Tat输出。他们通过将每种蛋白质与Tat信号肽融合，测试了人干扰素α-2b（