人肺上皮细胞ABC转运蛋白（P-gp、MRP1、BCRP）表达谱与功能活性的全景图谱研究

《European Journal of Pharmaceutical Sciences》：Mapping the ABC Transporter Landscape in the Human Lung: A Comprehensive Characterisation of P-gp, MRP1 and BCRP Expression and Functional Activity in Human Lung Epithelial Cells

本研究针对人肺上皮细胞中ABC转运蛋白（P-gp、MRP1、BCRP）表达数据存在矛盾、功能活性不明确的现状，系统比较了上、下气道来源的多种细胞系和原代细胞在不同培养条件（ALI vs. LCC）下的表达与功能。结果揭示MRP1普遍表达，BCRP表达较弱且不普遍，P-gp仅在Calu-3中表达；功能上，仅Calu-3（ALI培养）的P-gp对药物底物表现出外排活性。该研究为体外肺部分布研究模型的选择和结果解读提供了关键依据，对吸入药物研发具有重要意义。

　　

吸入给药是治疗肺部疾病的重要途径，药物在肺部的吸收和分布直接影响其疗效和安全性。在这个过程中，位于肺上皮细胞膜上的一类名为ATP结合盒（ABC, ATP-binding cassette）的转运蛋白扮演着“守门员”的角色，它们能主动将药物泵出细胞，从而可能降低药物的局部浓度或影响其全身暴露。其中，P-糖蛋白（P-gp, P-glycoprotein）、多药耐药相关蛋白1（MRP1, Multidrug Resistance-Associated Protein 1）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP, Breast Cancer Resistance Protein）是研究最广泛的三种ABC外排转运蛋白。尽管已有研究报道它们在人类肺组织中存在，但关于其在各种常用人肺上皮体外模型中的表达水平和功能活性，现有数据存在矛盾且不够系统。这种不确定性阻碍了研究人员准确评估这些转运蛋白在肺部药物处置中的作用，也影响了体外模型预测价值的发挥。为了解决这一难题，研究人员在《European Journal of Pharmaceutical Sciences》上发表了他们的最新研究成果，旨在全面绘制P-gp、MRP1和BCRP在人肺上皮细胞中的表达和功能活性图谱。

为了系统回答上述问题，研究人员采用了多种关键技术方法。他们选取了来自人肺上气道（16HBE14o-、Calu-3、NHBE）和下气道（NCI-H441、A549、hAELVi、Arlo、hAEpC）的细胞系和原代细胞（NHBE来自商业供应商，hAEpC从患者肺组织分离），并在两种培养条件（空气-液体界面ALI和液体覆盖条件LCC）下进行培养。通过定量PCR（qPCR, quantitative Polymerase Chain Reaction）和Western Blot（蛋白质免疫印迹）分别在基因和蛋白水平检测了三种转运蛋白的表达。利用荧光底物（罗丹明123、5,6-羧基荧光素、Hoechst 33342）在96孔板中评估其细胞内积累以初步判断功能活性。更重要的是，他们在Transwell?插片上培养细胞形成紧密单层后，进行了双向转运实验，使用药物底物（依度沙班、多柔比星、哌唑嗪）并计算表观渗透性（P_app, apparent permeability）和外排比（ER, efflux ratio），以更真实地模拟药物跨上皮转运过程。同时，通过监测跨上皮电阻（TEER, Transepithelial Electrical Resistance）和标记物渗透性来严格评估细胞屏障的完整性。

3.1. 肺上皮细胞中P-gp、MRP1和BCRP基因表达分析

研究人员通过qPCR分析了各种肺上皮细胞中三种转运蛋白的基因表达。结果显示，MRP1在所有测试的细胞中均有表达。P-gp仅在Calu-3细胞中检测到表达。BCRP在部分细胞中表达，包括16HBE14o-、NCI-H441和A549，但在Calu-3、Arlo和hAEpC中缺失。对于大多数转运蛋白，在培养瓶和Transwell?插片（ALI或LCC）上培养的细胞之间，基因表达水平没有统计学上的显著差异。

3.2. 肺上皮细胞中P-gp、MRP1和BCRP蛋白表达分析

Western Blot蛋白水平分析证实了基因表达的结果。MRP1在所有细胞中均被检测到。P-gp仅在Calu-3中表达，并且其蛋白表达在ALI条件下比LCC条件下高出四倍以上。BCRP在16HBE14o-、NCI-H441、A549和hAELVi中表达较弱，在Calu-3和Arlo中缺失。原代细胞NHBE和hAEpC的表达模式与其对应的细胞系相似。培养条件（ALI vs. LCC）对大多数细胞的蛋白表达水平没有显著影响，但Calu-3中的P-gp和MRP1以及Arlo中的MRP1表达受培养条件影响显著。

3.3. 通过细胞内荧光底物积累评估ABC转运蛋白活性

通过比较荧光底物在有无特异性抑制剂存在时的细胞内积累来评估功能活性。结果显示，P-gp的活性仅在Calu-3和阳性对照Caco-2细胞中得到证实。MRP1的活性在所有测试的肺上皮细胞和Caco-2中均被证实。BCRP的活性在16HBE14o-和Caco-2中明确存在，在其他一些细胞中（如NCI-H441、A549、NHBE、hAELVi）有轻微增加，但未达到预设的1.5倍阈值。

3.4. 肺上皮细胞单层完整性评估

通过测量TEER和低渗透性标记物（阿替洛尔和Lucifer Yellow）的P_app来评估细胞屏障形成能力。研究发现，16HBE14o-在ALI条件下、NCI-H441在ALI条件下以及A549在ALI和LCC条件下均无法形成紧密单层（TEER < 250 Ω·cm²， P_app > 25 nm/s）。其他细胞（Calu-3、hAELVi、Arlo、NHBE、hAEpC）则能形成有效的屏障。通常，在ALI条件下培养的细胞表现出更高的TEER。

3.5. 评估ABC转运蛋白外排的双向渗透性研究

这是评估转运蛋白功能最关键的实验。使用药物底物进行的双向转运研究结果显示，仅在ALI条件下培养的Calu-3细胞中观察到了P-gp介导的依度沙班外排（ER > 2，且可被抑制剂抑制）。对于MRP1和BCRP，尽管在荧光底物积累实验中显示出活性，但在使用药物底物（多柔比星和哌唑嗪）的双向转运实验中， across 所有肺上皮细胞均未观察到显著的外排活性（ER < 2）。阳性对照Caco-2细胞对三种转运蛋白的药物底物均表现出明确的外排活性。

研究的讨论部分对上述结果进行了深入分析。关于表达差异，作者指出与文献报道的不一致可能源于细胞亚克隆、培养条件（如时间、传代次数）、培养界面（ALI/LCC）以及分析方法的差异，强调了在利用这些细胞模型进行肺部分布研究时，对转运蛋白表达进行仔细表征的重要性。关于功能活性的差异，作者提出了一个关键点：荧光底物通常具有较高的脂溶性和较低的细胞渗透性，这使得它们更容易受到外排转运蛋白的影响；而所选用的药物底物（如哌唑嗪）渗透性较高，外排转运对其影响可能不那么明显。这提示我们在解读体外功能数据时，需要考虑底物特性。此外，底物的特异性（如多柔比星也可被其他MRPs或摄取转运蛋白识别）以及细胞内转运蛋白的定位（膜上 vs. 胞内）也可能是导致功能活性与表达水平不完全匹配的原因。

综上所述，本研究系统地描绘了P-gp、MRP1和BCRP在人类肺上皮细胞模型中的表达和功能图谱。主要结论是：MRP1在所有测试细胞中普遍表达且具有功能活性；BCRP表达较弱且不普遍，其功能活性因细胞和底物而异；P-gp仅在Calu-3细胞中表达，且其功能活性高度依赖于培养条件（ALI）。最重要的是，尽管这些转运蛋白能够与模型荧光底物相互作用，但在使用药物底物的更生理相关的双向转运模型中，除了Calu-3（ALI）的P-gp外，均未观察到显著的功能性外排。这一发现对吸入药物研发领域具有重要意义，它提示我们在利用这些体外模型预测ABC转运蛋白对肺部药物处置的潜在影响时需要格外谨慎。研究还指出，并非所有细胞都适合进行转运研究，如A549和ALI培养的16HBE14o-因无法形成紧密屏障而受限。该研究为未来选择最合适的体外模型来研究肺部药物转运提供了坚实的数据基础和重要参考。