WRI1转录因子调控橡胶树与橡胶草天然橡胶生物合成的通用功能研究

《Industrial Crops and Products》：Universal function of WRI1 involved in integrated regulation of multiple latex metabolism pathways in Hevea brasiliensis and Taraxacum kok-saghyz

本研究针对天然橡胶产量与品质提升的迫切需求，聚焦于关键转录因子WRINKLED1 (WRI1)在橡胶植物乳管代谢网络中的调控功能。研究人员通过分离鉴定橡胶树（Hevea brasiliensis）和橡胶草（Taraxacum kok-saghyz）中的HbWRI1和TkWRI1，利用转基因技术、转录组学、双荧光素酶报告系统及酵母单杂交等技术，揭示了WRI1通过结合下游基因启动子区的AW-box元件，协同调控糖酵解(EMP)、乙酰辅酶A转运、甲羟戊酸(MVA)途径、甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径及橡胶聚合等多条代谢通路，从而正向调控天然橡胶产量、分子量及橡胶粒子直径。该研究为通过代谢工程培育高产优质橡胶作物新品种提供了关键理论依据和新的技术路径。

　　

天然橡胶，这种源自植物的独特材料，因其无可替代的弹性、耐磨性和拉伸强度，已成为现代工业不可或缺的战略物资。从汽车轮胎到医疗手套，其应用渗透到日常生活的方方面面。然而，全球主要的天然橡胶来源——巴西橡胶树（Hevea brasiliensis），正面临着严峻的挑战：其种植受限于热带地区，易受病害侵袭（如南美叶疫病），生长周期长，且劳动力需求高，导致供应链不稳定。与此同时，另一种产胶植物——橡胶草（Taraxacum kok-saghyz），虽能在温带生长并产出质量相当的橡胶，却因其产量低、生物量小而难以商业化。随着全球对天然橡胶需求的持续增长，开发高产、优质的橡胶作物新种质已成为一个紧迫的科学问题。

天然橡胶的主要成分是顺式-1,4-聚异戊二烯，其生物合成是一个复杂的代谢过程，涉及糖类代谢、异戊二烯前体合成以及最终的聚合步骤。长期以来，科学家们试图通过理解并调控这一过程中的关键环节来提高橡胶产量。转录因子作为调控基因表达的“开关”，在协调复杂代谢通路中扮演着核心角色。其中，WRINKLED1 (WRI1) 是一个著名的转录因子，在拟南芥等植物中被发现是调控油脂生物合成和碳代谢的核心调控因子。然而，令人惊讶的是，在橡胶树和橡胶草的产胶组织——乳管（一种并非以储脂为主要功能的组织）中，WRI1同源基因却表现出异常的高表达。这一现象提示，WRI1在橡胶植物中可能扮演着超越传统脂质代谢调控的全新角色，它或许能“开启”或“增强”乳管中异戊二烯前体（IPP）生物合成及聚合的碳流，从而为橡胶生物合成提供一个前所未有的调控机制。为了验证这一猜想，研究人员开展了一项深入的研究，其成果发表在《Industrial Crops and Products》上。

为了阐明WRI1在橡胶植物乳管中的功能，研究人员综合运用了多种关键技术方法。他们首先从橡胶树和橡胶草的乳液中分离出HbWRI1和TkWRI1基因，并进行了生物信息学分析。通过农杆菌介导的转化技术，在模式植物拟南芥和橡胶草中进行了异源表达、过表达及RNAi抑制表达实验。利用转录组测序（RNA-Seq）技术比较了转基因橡胶草与野生型乳液的基因表达谱，以鉴定受WRI1调控的下游通路和基因。通过亚细胞定位确定蛋白的细胞核定位，并通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高效液相色谱蒸发光散射检测器（HPLC-ELDS）分别分析了脂肪酸和磷脂组成。采用凝胶渗透色谱（GPC）和激光散射粒度分析仪测定了橡胶的分子量（MW）和橡胶粒子（RPs）直径。最后，利用双荧光素酶报告基因实验和酵母单杂交（Y1H）实验验证了WRI1与下游靶基因启动子区AW-box元件的直接结合活性。研究所用的橡胶树材料采集自中国热带农业科学院橡胶研究所的实验基地，橡胶草野生型及转基因材料均在研究所的种质圃和实验室条件下培育和转化。

3.1. 橡胶树乳管转录组中脂质和橡胶生物合成的富集

对橡胶树树皮和乳管的转录组分析发现，乳管中特异性高表达的基因显著富集在脂质生物合成过程、异戊二烯生物合成过程、萜类骨架生物合成、内质网中的蛋白质加工以及甘油磷脂代谢等通路。这表明脂质和异戊烯类代谢在乳管功能中占据核心地位。特别值得注意的是，一个与脂质生物合成过程相关的WRI1同源基因在乳管中高表达，随后在橡胶草乳管中也鉴定出类似的TkWRI1基因。qPCR结果证实，HbWRI1和TkWRI1在各自植物的多种组织中均有表达，但在乳液中的表达量最高，提示它们与乳管代谢密切相关。

3.2. HbWRI1和TkWRI1是调控脂质生物合成的转录因子

序列分析显示，HbWRI1和TkWRI1蛋白含有两个典型的AP2/ERF结构域，与拟南芥AtWRI1亲缘关系最近。亚细胞定位实验证实它们定位于细胞核，具备转录因子的特征。在拟南芥中异源表达HbWRI1和TkWRI1能导致叶片中总脂肪酸含量显著上升，包括硬脂酸（C18:0）、亚油酸（C18:2）等，证明这两个蛋白具有正向调控脂质生物合成的功能。

3.3. 转基因橡胶草中的乳管代谢和橡胶生产

为了研究WRI1在乳管中的具体功能，研究人员在橡胶草中构建了HbWRI1异位表达（HbWRI1-h）、TkWRI1过表达（TkWRI1-o）以及TkWRI1 RNAi抑制表达（TkWRI1-i）的转基因株系。与野生型相比，HbWRI1-h和TkWRI1-o植株的乳液相对含胶量（RLC）和干胶含量（DRC）均显著增加，而TkWRI1-i植株则显著降低。这表明HbWRI1和TkWRI1是橡胶生物合成的正向调控因子。

3.4. 转基因橡胶草乳液中橡胶分子量、橡胶粒子直径和脂肪酸含量

对橡胶质量的深入分析发现，过表达/异位表达WRI1能显著提高橡胶的平均分子量（MW）和平均橡胶粒子（RPs）直径，而抑制TkWRI1则产生相反效果。透射电镜观察直观地证实了转基因植株中橡胶粒子大小的变化。磷脂分析显示，WRI1过表达植株乳液中磷脂（尤其是磷脂酰胆碱PC）含量显著增加。然而，与在拟南芥中的结果相反，在橡胶草乳管中过表达WRI1反而导致总脂肪酸含量显著下降，抑制WRI1则使脂肪酸含量上升。研究人员推测，这可能是由于在乳管这一特殊环境中，碳流更倾向于流向橡胶生物合成，而非脂肪酸储存（如三酰甘油TAG），同时磷脂（仅含两个脂肪酸）的合成增强替代了TAG（含三个脂肪酸）的合成，共同导致了脂肪酸含量的相对降低。

3.5. 转基因橡胶草中与乳管代谢相关的多条通路

转录组分析揭示，在TkWRI1过表达株系中上调的基因和在TkWRI1抑制株系中下调的基因，以及HbWRI1异位表达株系中上调的基因，共同富集在糖酵解/糖异生、碳代谢、丙酮酸代谢、萜类骨架生物合成等关键通路。共鉴定出312个差异表达基因，涉及碳水化合物代谢、橡胶生物合成和脂肪酸生物合成，表明WRI1能协同调控橡胶生物合成的全过程，包括EMP途径、乙酰辅酶A转化、MVA途径、MEP途径和橡胶聚合途径。

3.6. WRI1通过结合基因启动子的AW-box激活脂质代谢和橡胶生物合成

生物信息学预测发现，许多上述代谢通路中酶的基因启动子区含有WRI1的特征结合元件AW-box。双荧光素酶报告基因实验和酵母单杂交实验证实，HbWRI1和TkWRI1能够直接结合到多个下游靶基因的启动子AW-box上，从而激活其转录。这些靶基因涵盖了糖酵解（如PK, PDH）、MVA途径（如HMGR, MVD）、MEP途径（如DXS）、橡胶聚合（如GGPS）以及脂肪酸生物合成（如KASI, KASII）和磷脂代谢（如LPAT, PDAT）等多个关键环节，从分子水平上阐明了WRI1整合调控橡胶生物合成的机制。

本研究首次系统地揭示了WRI1转录因子在橡胶植物中的新功能：它不仅保守地调控脂质代谢，更重要的是作为一个核心调控枢纽，整合了乳管中从碳源（糖）代谢开始，经异戊烯前体合成，直至橡胶聚合物形成的整个代谢网络。通过激活包括糖酵解、MVA途径、MEP途径和橡胶聚合相关基因的表达，WRI1有效地将碳流导向天然橡胶的合成，从而显著提高了橡胶草的产胶量和橡胶质量（分子量和橡胶粒子尺寸）。同时，研究也揭示了乳管这一特殊代谢环境中碳流分配的独特性，即WRI1的过表达更倾向于促进用于构建橡胶粒子膜的磷脂合成，而非储存性的三酰甘油合成，这为理解乳管细胞代谢提供了新视角。

该研究的结论具有重要的理论和实践意义。在理论层面，它拓展了我们对WRI1转录因子功能多样性的认识，揭示了其在非储脂组织（乳管）中协调复杂次生代谢物（天然橡胶）合成的核心作用，为植物代谢调控网络研究提供了新范式。在应用层面，研究鉴定出的HbWRI1/TkWRI1及其下游关键靶基因，为通过基因工程或分子育种手段定向改良橡胶树和橡胶草的产胶性能提供了宝贵的遗传资源和明确的分子靶点。通过调控单个关键转录因子即可实现多条代谢通路的协同增效，有望突破当前橡胶作物育种中产量与品质难以同步提升的瓶颈，对于保障国家战略物资天然橡胶的稳定供给具有深远影响。这项研究标志着橡胶生物合成代谢工程研究进入了一个新的阶段，即从单一酶基因的操控迈向对整体代谢网络的精准调控。