柠檬酸-山梨醇低共熔溶剂高效解构木质纤维素生物质及其乙醇发酵研究

《Industrial Crops and Products》：Citric acid-sorbitol deep eutectic solvent for efficient deconstruction of lignocellulosic biomass and subsequent ethanol fermentation

本研究针对木质纤维素生物质天然抗降解性难题，开发了基于柠檬酸和山梨醇的绿色低共熔溶剂(DES)预处理体系。该CA-Sor DES通过优化氢键网络，在温和条件下将纤维素结晶度从62.3%降至34.8%，使还原糖转化率达到89.10%，并实现84%的葡萄糖-乙醇转化效率，为农业废弃物高值化生物炼制提供了高效可回收的预处理策略。

　　

在全球追求碳中性和可持续能源发展的背景下，秸秆等木质纤维素生物质作为地球上最丰富的可再生碳源，其高效利用已成为战略焦点。玉米秸秆年产量约12亿吨，是第二代生物燃料和生物化学品合成的重要原料。然而，天然木质纤维素生物质因其高度有序的纤维素微晶和包裹的木质素-半纤维素基质而具有顽固的抗降解性，严重限制了酶解效率和生物转化经济性。

传统预处理方法如稀酸/碱处理、蒸汽爆破等虽能去除木质素并降低纤维素结晶度，但存在能耗高、设备腐蚀严重、产生抑制性副产物等问题。离子液体(ILs)和TEMPO氧化等绿色溶剂法在温和条件下效果显著，但离子液体成本高、粘度大、回收困难且残留抑制发酵，TEMPO氧化则需大量试剂并产生复杂废液，制约了其工业化应用。

深共晶溶剂(DES)作为一种新兴绿色预处理介质，因其易于合成、成本低廉及氢键网络可调而备受关注。然而，现有DES对纤维素结晶区的分解能力有限，且残留溶剂组分和副产物会抑制酶活和微生物发酵。为此，研究人员开始探索基于多元羧酸(如柠檬酸、酒石酸)和多元醇(如山梨醇、木糖醇)的新型DES体系，期望通过形成致密可调的氢键网络，在适度粘度和温度下实现更有效的木质素去除和纤维素微晶破坏，同时具备良好的生物相容性。

在这项发表于《Industrial Crops and Products》的研究中，研究人员设计并合成了一系列多元羧酸-多元醇DES，系统评价了它们预处理玉米秸秆的效果，通过多尺度表征阐明了其氢键网络结构、粘度特性及其在秸秆纤维素结构转化中的机理作用，最终筛选出性能最优的柠檬酸-山梨醇(CA-Sor)DES体系。

本研究主要采用了几项关键技术方法：首先通过核磁共振(NMR)和粘度分析表征了六种不同DES体系的氢键网络结构和流变特性；利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和X射线衍射(XRD)分析了预处理前后秸秆的化学结构和结晶度变化；按照美国国家可再生能源实验室(NREL)标准方法进行组分分析；通过酶解实验评估还原糖转化率；最后以酿酒酵母进行乙醇发酵验证。

3.1. 酸-醇DES体系中氢键网络的NMR分析

通过400MHz核磁共振谱仪分析六种DES的氢键相互作用发现，CA-Sor DES在3.20-3.80ppm区域表现出最大的质子共振线宽增加(Δδ_H达0.32ppm)，表明其形成了最广泛的氢键网络。在低场区域(2.50-2.90ppm)，柠檬酸-CH_2-信号去屏蔽并分裂，而酒石酸-CH-信号呈现尖锐共振。比较关键^1H和^13C化学位移进一步证实了氢键变化的差异：在CA-Sor体系中，乙二醇-CH_2-共振从3.68位移至3.36ppm(Δδ_H=0.32ppm)，柠檬酸羧基C=O共振从175.2位移至176.1ppm(Δδ_C=0.9ppm)，这些化学位移扰动与氢键强度呈正相关。研究表明CA-Sor DES具有最广泛的分子间氢键作用和结构稳定性。

3.2. 酸-醇DES配方的流变学表征

在25°C下测量六种DES的表观粘度发现，粘度随多元醇组分中羟基数量的增加而增加，在相同多元醇条件下，三羧酸基DES的粘度显著高于二羧酸对应物。CA-EG DES粘度最低(约34.4mPa·s)，表明氢键网络相对松散；CA-Sor DES粘度约为72.2mPa·s，归因于山梨醇的多个羟基提供了额外氢键位点，形成了更致密的网络。与近期研究中的其他酸-山梨醇体系相比，CA-Sor DES的粘度显著低于ChCl-S DES(11200mPa·s)、ChCl-LA DES(152mPa·s)和ChCl-U DES(1811mPa·s)，反映了有机酸基DES中较弱的离子相互作用。粘度趋势与NMR谱中的线宽增宽密切平行，证实了氢键网络密度与体相流变性质之间的直接相关性。

3.3. 不同预处理后秸秆的FT-IR表征

FT-IR光谱显示，所有样品在3405cm^(-1)(O-H伸缩)、2980cm^(-1)(C-H伸缩)和1000-1150cm^(-1)(C-O-C糖苷键振动)处均显示特征纤维素吸收带。DES处理后样品在3400cm^(-1)处的O-H带强度减弱而C-O-C带增强，表明氢键供体-受体相互作用驱动了超分子重组和结晶度增加，实现了"物理重构-温和化学修饰"。纤维素酶处理同样增强了C-O-C吸收但不影响羰基区域，证实了β-1,4-糖苷键水解选择性暴露结晶域而不伴随氧化或酯化。TEMPO氧化在1730cm^(-1)处产生明显的羰基带，同时O-H带减少，验证了C6羟甲基选择性氧化为羧基官能团。[DMIM][DMP]预处理也减少了O-H带并增强了C-O-C带，但羰基区域变化可忽略，表明该方法主要破坏分子间氢键并诱导纤维素微晶物理重排而无显著化学衍生化。

3.4. 不同预处理后秸秆的XRD分析

XRD图谱显示，未处理样品呈现纤维素I衍射峰，2θ≈15°、16.5°和22.5°处有弥散或重叠反射。TEMPO氧化和[DMIM][DMP]处理后，主衍射峰半高宽增加、强度降低，结晶度指数分别降至48.5%和42.7%，相对于未处理材料降低13.8%和19.6%。纤维素酶预处理在一定程度上保留了基本纤维素I晶体结构，但酶水解降低了高聚合度和有序度，导致峰宽化，结晶度指数为56.1%，比未处理样品降低6.2%。DES预处理样品表现出最显著的峰宽化和强度衰减，结晶度指数仅为34.8%，相对于对照降低27.5%。这种结晶度降低程度超过了TA-Sor(24.1%)和精氨酸-LA天然DES(14%)，凸显了CA-Sor破坏有序纤维素结晶域排列的卓越能力。

3.5. DES预处理前后生物质的比较组分分析

根据NREL组分分析，CA-Sor预处理实现了54.1%的木质素去除效率和50.0%的半纤维素去除，同时纤维素(葡聚糖)含量相对增加36.8%。CA-Sor DES的木质素去除率(54.1%)超过典型酸性DES预处理报告水平(50.0%)4.1%，这可能归因于CA-Sor DES促进的协同氢键相互作用和酸催化裂解增强的脱木质素能力。

3.6. DES预处理秸秆还原糖转化率比较

在5.5mg/mL初始浓度下，不同多元酸-多元醇DES预处理秸秆后，36h和72h时还原糖转化率测量显示，所有DES处理组在两个时间点均显著增强(p<0.05)。36h时，CA-EG、CA-Gly、TA-EG和CA-Sor DES的糖化效率分别约为69.38%、70.88%、71.82%和81.38%。72h时，这些值进一步增加至约89.05%、78.55%、84.84%和89.10%。CA-Sor DES始终产生最高转化效率，表明其增强纤维素酶活性的卓越能力。

3.7. DES与替代预处理剂糖化性能比较

在5mg/mL初始纤维素浓度下，CA-Sor DES预处理秸秆与其他试剂比较发现，72h时转化效率排序为：CA-Sor DES(89.1%)>纤维素酶预处理(73.4%)>[DMIM][DMP]离子液体预处理(65.8%)>TEMPO氧化(41.78%)>未处理对照(30.1%)。CA-Sor DES在两个时间点均提供最高转化效率，显示其在增强纤维素酶水解效率方面的明显优势。

3.8. 酿酒酵母在CA-Sor DES水解液上的发酵性能

为评估CA-Sor DES预处理水解液的可发酵性，使用酿酒酵母在调整至20g/L秸秆的水解液上进行分批发酵，以等效葡萄糖浓度的商业葡萄糖(16.3g/L)作为对照。前10h内，两组糖浓度仅轻微下降，乙醇积累保持低位，反映酵母代谢尚未完全激活的适应期。10h后，糖消耗加速，浓度迅速下降，26h时几乎完全耗尽。相应地，乙醇产量在10-26h间急剧增加，此后稳定在水解液8.39g/L和商业葡萄糖对照8.30g/L。整个过程未观察到乙醇下降或残留糖积累，表明发酵环境稳定和底物利用高效。

本研究通过系统设计表征多元羧酸-多元醇DES体系，成功开发出CA-Sor这一高效预处理溶剂。该DES通过形成致密氢键网络，在中等粘度(72.2mPa·s)下显著降低纤维素结晶度(从62.3%至34.8%)，并实现89.10%的还原糖转化率。下游发酵实验证实其水解液可直接用于乙醇发酵，达到84%的葡萄糖-乙醇转化效率，且无需脱毒处理。与离子液体、TEMPO氧化和酶预处理相比，CA-Sor DES在结构破坏程度和糖化效率方面均表现出明显优势。

该研究的重要意义在于提供了一种全生物质来源、可回收的绿色预处理策略，有效解决了木质纤维素生物质抗降解性难题。CA-Sor DES兼具可调氢键破坏、酸催化协同和良好渗透性，在温和条件下实现了纤维素可及性和生物转化效率的最大化。其可再生、低毒和可回收特性使其成为可持续木质纤维素生物炼制和有价值生物化学品生产的有前景预处理剂，为农业残留物高值化利用和工业部署提供了创新解决方案。