靶向核受体共激活因子5（NCOA5）逆转肝细胞癌仑伐替尼获得性耐药的新策略：基于蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（AKT-mTOR）信号通路的机制探索

《Anti-Cancer Drugs》：Inhibition of nuclear receptor coactivator 5 overcomes acquired lenvatinib resistance driven by protein kinase B-mammalian target of rapamycin signaling in hepatocellular carcinoma

本文揭示了肝细胞癌（HCC）对仑伐替尼（Lenvatinib）产生获得性耐药的新机制：核受体共激活因子5（NCOA5）通过激活蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（AKT-mTOR）信号轴驱动耐药。研究证实，mTOR抑制剂依维莫司（Everolimus）与仑伐替尼联用可显著逆转耐药，为克服HCC靶向治疗瓶颈提供了有前景的联合策略。

　　

引言

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球第六大常见恶性肿瘤，其起病隐匿，预后较差。在中国，HCC的发病率和死亡率分别位居第四和第二。临床上，大多数HCC患者确诊时已处于晚期，治疗选择有限。近年来，分子靶向治疗和免疫治疗的重大进展为晚期HCC患者带来了新的希望。其中，仑伐替尼作为一种口服多靶点酪氨酸激酶受体抑制剂（TKI），已获批作为一线疗法，并显示出良好的疗效和安全性。然而，仑伐替尼耐药的出现在很大程度上限制了其总体疗效，这凸显了探究其潜在分子机制和寻找克服耐药新治疗策略的迫切性。

已有研究致力于探索HCC对仑伐替尼的耐药机制，但逆转耐药的临床策略仍然有限，仑伐替尼的治疗效果未能得到有效提升。因此，探索仑伐替尼的耐药机制，并发现额外的耐药后治疗策略仍然至关重要。本研究旨在探索仑伐替尼获得性耐药的潜在机制，并确定一种新的联合疗法来克服仑伐替尼耐药，从而增强HCC的治疗反应。

材料与方法

本研究纳入了2019年10月至2021年12月期间在本机构接受治疗性切除术的10例HCC患者。研究获得了天津医科大学肿瘤医院伦理委员会的批准，所有患者均签署了书面知情同意书。从这些患者获得的临床标本或在甲醛溶液中固定，或在组织分离后30分钟内立即储存于液氮中。所有患者均经病理诊断为IA-IIIA期HCC，无肝外或淋巴结转移证据。每位患者均有完整的临床数据和随访记录。

人HCC细胞系（Hep3B和HuH7）由天津医科大学肿瘤研究所分子生物学医学研究委员会实验室提供。为了建立仑伐替尼耐药（LEN-RE）细胞系，Hep3B和HuH7细胞最初在5 μmol/L的仑伐替尼浓度下培养。每48小时更换一次培养基，直至细胞在培养皿中达到90%汇合度。随后进行传代，逐步将仑伐替尼浓度增加5 μmol/L，直至细胞在50 μmol/L浓度下表现出快速增殖。此过程至少需要5个月。由此产生的耐药细胞系分别命名为Hep3B LEN-RE和HuH7 LEN-RE。所有细胞系均通过短串联重复序列谱进行鉴定，支原体检测结果为阴性。

使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）评估细胞活力。将细胞以每孔1000-2000个细胞的密度接种到96孔板中，孵育过夜。次日，清洗细胞，并加入含有二甲基亚砜（DMSO）或指定处理的新鲜培养基（7个浓度梯度）。孵育72小时后，使用CCK-8评估细胞活力。采用三参数剂量反应模型确定半抑制浓度值（IC₅₀）。

使用放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液（补充蛋白酶抑制剂）裂解细胞提取总蛋白。随后通过SDS-PAGE分离蛋白样品，并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用含5%脱脂牛奶的Tris缓冲盐水-Tween（TBS-T）封闭后，将膜与一抗孵育。使用的一抗包括：抗蛋白激酶B（AKT）、抗磷酸化AKT（p-AKT）、抗核受体共激活因子5（NCOA5）、抗细胞外信号调节激酶（ERK）、抗磷酸化ERK（p-ERK）、抗哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、抗磷酸化mTOR（p-mTOR）等。

将Hep3B细胞皮下注射到4周龄雄性Balb/c小鼠的右后侧腹（每只小鼠1 × 10⁷个细胞）。当肿瘤体积达到约100 mm³时，开始用仑伐替尼（4 mg/kg/天）或依维莫司（10 mg/kg/天）以及联合方案进行治疗。治疗28天后，处死小鼠。

对患者/小鼠肿瘤石蜡包埋切片进行免疫组织化学染色。切片在60°C下烘烤1小时，用二甲苯脱蜡，并在系列梯度乙醇溶液中水化。将切片置于10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中微波加热15分钟（每次5分钟，共3次）以进行抗原修复。然后用3%过氧化氢淬灭反应。PBS洗涤后，切片在4°C下与一抗抗NCOA5孵育过夜。使用3,3‘-二氨基联苯胺（DAB）检测系统。使用ImageJ软件进行定量分析，重点评估每个视野中阳性染色细胞的百分比和染色强度。

连续数据以均值±标准误表示。组间比较采用非配对双尾Student’s t检验或Mann–Whitney U检验。P < 0.05认为具有统计学显著性；所有P值均为双侧。所有统计分析均使用SPSS 27.0进行。同时使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。组间比较采用Student‘s t检验以及单因素或双因素方差分析。所有检验的显著性水平设定为95%置信区间。

结果

建立仑伐替尼获得性耐药细胞模型

对不同肝癌细胞系进行仑伐替尼敏感性测试，并使用梯度浓度测量仑伐替尼的IC₅₀。Hep3B和Huh7细胞系对仑伐替尼表现出更高的敏感性。为了建立LEN-RE HCC细胞模型，对Hep3B和HuH7细胞施加浓度递增的仑伐替尼（起始浓度为5 μmol/L，每2周增加5 μmol/L），持续6个月以上。由此产生的细胞系被命名为Hep3B LEN-RE和HuH7 LEN-RE（LEN-RE株系）。与各自的野生型（WT）株系相比，Hep3B LEN-RE和HuH7 LEN-RE对仑伐替尼的反应减弱，其IC₅₀值比WT株系高出三倍以上。

CCK-8增殖实验显示，在对照组中，仑伐替尼显著抑制细胞增殖，但当相同浓度的仑伐替尼应用于耐药细胞时，未能抑制细胞增殖。耐药细胞与对照细胞的增殖率无显著差异。平板克隆形成实验表明，在对照组中，5 μmol/L仑伐替尼处理显著抑制了克隆形成能力。相比之下，耐药细胞组对克隆形成能力的抑制作用减弱。这些发现表明，我们开发的耐药细胞模型对仑伐替尼没有表现出明显的敏感性，为后续实验提供了有价值的工具。

核受体共激活因子5-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（NCOA5-AKT-mTOR）通路在LEN-RE肝细胞癌模型中的激活

对三组不同的Hep3B耐药细胞及其相应的DMSO对照细胞进行RNA-seq测序，并进行全面分析。维恩图显示了三个组中531个基因的变化，其中每个组中变化最显著的前20个基因中的变异。NCOA5成为一个共同特征。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析揭示，最显著受影响的通路包括磷酸肌醇-3激酶-AKT（PI3K-AKT）、mTOR和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。蛋白质印迹分析进一步证实了这些发现，耐药组细胞中NCOA5、p-AKT、p-ERK、mTOR、p-mTOR、表皮生长因子受体（EGFR）、p-糖原合成酶激酶3β（p-GSK3β）和程序性死亡配体1（PD-L1）的水平升高，而总AKT、ERK和GSK3β没有显著变化。我们的结果与先前的研究一致，表明NCOA5可能影响p-AKT和mTOR的表达，并且EGFR在耐药组中高表达，导致下游p-ERK的激活。我们已经证明AKT和ERK通路与PD-L1表达相关。相应地，PD-L1水平的定量显示其在耐药细胞中上调。随后，用AKT抑制剂（MK2206）和ERK抑制剂（PD98059）处理耐药细胞48小时，然后进行蛋白质印迹分析。添加AKT抑制剂抑制了PD-L1的表达，而ERK抑制剂对PD-L1表达没有明显影响。因此，耐药细胞中PD-L1表达的增加归因于AKT通路的上调。从机制上讲，发现AKT通过激活GSK3β促进高PD-L1表达。此外，敲低NCOA5导致AKT、p-AKT和p-mTOR的表达降低，表明NCOA5可以通过调节这两条通路来影响细胞功能。

核受体共激活因子5（NCOA5）激活与肝细胞癌仑伐替尼耐药的相关性

将仑伐替尼治疗后疾病进展（PD）的患者归类为耐药组，而治疗后疾病稳定（SD）或部分缓解（PR）的患者归类为敏感组（每组5例）。免疫组织化学染色显示，在相应的组织中检测到NCOA5表达显著升高，且耐药组中NCOA5的表达高于敏感组。这证实了NCOA5在仑伐替尼耐药肿瘤组织中的上调。此外，利用网络数据库筛选肝癌患者的临床样本，并分为高和低NCOA5表达组。生存分析表明，高NCOA5表达患者的总生存时间相对较短，预后较差。为了探索NCOA5对仑伐替尼耐药的影响，使用病毒感染、稳定降低NCOA5表达的仑伐替尼耐药细胞系进行敏感性测试。半抑制浓度测量显示，敲低NCOA5有效降低了细胞对仑伐替尼的耐药性，使耐药细胞对仑伐替尼更敏感，从而逆转了耐药。相反，通过病毒感染过表达NCOA5的Hep3B WT细胞对仑伐替尼的敏感性降低，进一步说明了NCOA5在仑伐替尼耐药中的作用。随后，进行体外实验以探索NCOA5对Hep3B和Huh7细胞生物学行为的影响。

核受体共激活因子5（NCOA5）表达在肝细胞癌细胞中的重要作用

平板克隆实验显示，Hep3B和Huh7细胞的克隆形成能力与NCOA5表达相关。具体而言，敲低NCOA5的细胞其增殖能力显著低于对照组。此外，NCOA5敲低组的细胞增殖显著低于对照组，表明NCOA5与细胞增殖相关。划痕实验显示，耐药细胞的划痕宽度和愈合面积大于对照细胞。相反，降低NCOA5表达导致划痕宽度和愈合面积减小，表明细胞运动性在一定程度上降低，尽管无统计学显著性。随后的Transwell实验证实，与对照细胞相比，下调NCOA5导致肿瘤细胞的侵袭能力下降。为了评估NCOA5的体内效应，将表达NCOA5的细胞和对照细胞皮下植入裸鼠体内。NCOA5组的肿瘤明显小于对照组。

联合哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂依维莫司和ERK抑制剂曲美替尼增强仑伐替尼的抗肿瘤疗效

在耐药细胞和对照细胞中，我们评估了仑伐替尼、依维莫司、曲美替尼以及各种组合的单独和联合效应。在仑伐替尼耐药组中，单独使用仑伐替尼显示出相对较低的疗效；而在对照组中，仑伐替尼和依维莫司的联合显示出简单的药物叠加效应。有趣的是，在仑伐替尼耐药组中，仑伐替尼联合依维莫司显著增强了这两种原本效果平平的药物的效果。随后，我们使用Hep3B细胞建立了皮下肿瘤模型，并通过灌胃给予仑伐替尼、依维莫司以及仑伐替尼和依维莫司的联合用药。结果显示，仑伐替尼和依维莫司都对小鼠的肿瘤生长有治疗影响。重要的是，联合治疗表现出协同效应，显著降低了肿瘤体积和重量。小鼠体重没有明显变化，表明治疗的安全性。

讨论

耐药性已成为癌症治疗中的一个突出挑战。与新批准的药物索拉非尼类似，仑伐替尼也面临着耐药性问题。根据初步统计数据显示，超过60%的HCC患者在1年内对仑伐替尼产生耐受，只有一小部分患者获得持续获益。因此，大量努力致力于理解仑伐替尼反应和耐药的潜在机制。根据HCC治疗的疗效，耐药性可分为原发性耐药（初始治疗耐药）和获得性耐药（初始敏感，后期治疗耐药）。先前的研究表明，HCC的获得性耐药可能是由于有限的药物摄取和增加的药物外排、异常的药物代谢途径、替代治疗靶点的激活、DNA修复增强、细胞存活与凋亡失衡以及肿瘤微环境的影响。因此，揭示像仑伐替尼这样的新批准药物的获得性耐药机制，理解其潜在的耐药机制，探索有前景的策略来克服这些挑战，从而增强HCC患者的治疗获益至关重要。

NCOA5作为共激活因子或共抑制因子影响基因表达和细胞生理学，但其确切作用和详细的分子机制在很大程度上仍然未知。先前的研究表明，NCOA5的变化参与癌症的发生和进展。NCOA5的表达在乳腺癌组织和细胞系中显著增加。敲低NCOA5导致乳腺癌细胞活性和迁移减少，并诱导细胞粘附。另一项研究表明，过表达NCOA5促进mTOR磷酸化和β-酪蛋白合成，而其敲低则产生相反的效果。

我们的研究通过分析仑伐替尼获得性耐药模型中的RNA，揭示了HCC细胞通过激活NCOA5并刺激下游NCOA5-AKT-mTOR轴而对仑伐替尼产生耐药。此外，仑伐替尼与mTOR抑制剂依维莫司的联合应用引发了显著的协同效应，增强了接受仑伐替尼治疗的HCC患者的临床获益。在先前对肾细胞癌的研究中，仑伐替尼和mTOR抑制剂依维莫司的联合应用相比单一疗法具有显著的协同效应。最近的一项研究强调了仑伐替尼与EGFR抑制剂（吉非替尼）联合应用的潜在益处，特别是在初始EGFR表达高的患者中。类似地，另一项针对用于治疗非小细胞肺癌的EGFR抑制剂厄洛替尼的研究表明，其在改善仑伐替尼治疗后继发性耐药HCC患者的临床结局方面具有显著的协同效应。在我们的RNA测序分析中，EGFR被确定为531个共突变基因之一，尽管不属于变化最显著的前20个基因。我们进一步证实EGFR过表达并可能激活其下游p-ERK，从而促成另一种耐药机制。

结论

总之，我们的研究揭示了HCC患者对仑伐替尼的获得性耐药。仑伐替尼和依维莫司的联合治疗有效抑制了NCOA5-AKT-mTOR轴中的mTOR通路，从而克服了NCOA5介导的仑伐替尼耐药。