天堂鱼早期发育基因表达与信号通路的原位杂交技术优化及进化发育生物学研究

《Biologia Futura》：An optimized in situ hybridization protocol to study early developmental patterns and signaling pathways in paradise fish (Macropodus opercularis)

本研究针对天堂鱼(Macropodus opercularis)分子生物学研究工具缺乏的问题，优化了适用于该物种的全胚胎原位杂交(WISH)技术方案，通过比较天堂鱼与斑马鱼早期发育过程中chordin(chd)、goosecoid(gsc)等6个关键发育基因的表达模式，并利用小分子抑制剂调控BMP、Wnt、Shh和Notch信号通路，证实了这些保守发育程序在两物种间的相似性，为天堂鱼作为新型模式生物在进化发育生物学和行??遗传学研究奠定了基础。

　　

在淡水观赏鱼中，天堂鱼(Macropodus opercularis)以其独特的行为特征和生理适应性而闻名。这种原产于东南亚缺氧淡水环境的迷鳃鱼，自1970年代以来一直是行为学研究的重要模型，然而其分子生物学研究却长期滞后。随着研究团队近期完成天堂鱼高质量基因组测序，这一物种在行为遗传学、分子进化??发育生物学等领域的潜力亟待开发。

为填补这一空白，来自罗兰大学的研究团队开展了一项开创性研究，旨在建立适用于天堂鱼的分子生物学研究工具。研究人员重点关注了在发育生物学中广泛应用的全胚胎原位杂交技术，该技术虽在斑马鱼中成熟，却无法直接应用于天堂鱼胚胎。这种技术瓶颈严重阻碍了对天堂鱼发育基因表达模式的研究。

研究团队发现，天堂鱼胚胎与斑马鱼胚胎存在关键差异：天堂鱼胚胎内含大型油滴使其能在气泡巢中漂浮，且早期胚胎脱膜困难，这些特征导致标准斑马鱼原位杂交协议在天堂鱼上效果不佳。因此，优化适用于天堂鱼的实验方案成为当务之急。

本研究通过系统优化蛋白质酶K消化时间等关键参数，成功建立了稳定的天堂鱼原位杂交技术平台，并利用该技术比较了天堂鱼与斑马鱼早期发育过程中多个保守基因的表达模式。此外，研究还通过小分子抑制剂调控关键信号通路，探究了这些通路在两物种发育过程中的功能保守性。相关成果发表在《Biologia Futura》期刊，为天堂鱼作为补充模型生物在进化发育生物学研究中的应用奠定了基础。

关键技术方法包括：优化全胚胎原位杂交(WISH)流程，重点调整蛋白质酶K消化时间参数；利用实验室饲养的天堂鱼和斑马鱼胚胎进行对比研究；应用小分子抑制剂(包括dorsomorphin、LiCl₂、cyclopamine和DAPT)调控BMP、Wnt、Shh和Notch信号通路；通过体外转录合成地高辛标记的RNA探针；使用phalloidin染色分析体节发育。

原位杂交技术的优化

研究人员发现，天堂鱼胚胎的特殊结构要求对标准斑马鱼原位杂交协议进行多项调整。关键改进包括使用玻璃小瓶和玻璃移液管处理胚胎以避免粘附，以及针对不同发育阶段和探针优化蛋白质酶K消化时间。通过测试早期原肠胚、晚期原肠胚、芽期和体节期等不同发育阶段的消化时间(0、3、6、9和12分钟)，研究团队确定了各阶段的最佳消化条件。例如，在早期原肠胚阶段，12分钟消化可获得清晰的chd表达信号且无背景；而在体节期，12分钟消化能实现最佳的pax2a表达检测效果。这些优化确保了探针能有效穿透天堂鱼胚胎组织，同时保持胚胎结构完整性。

早期基因表达模式的比较分析

利用优化后的原位杂交技术，研究团队系统比较了天堂鱼与斑马鱼早期发育过程中六个关键基因的表达模式。结果显示，两物种在背侧决定因子gsc和chd的表达上高度保守：gsc在球胚期的胚胎背极均有表达，在芽期均表现为前轴下胚层区域的强条纹表达；chd在30%原肠胚阶段均定位于未来背侧，在晚期原肠胚阶段均出现在轴旁中胚层细胞，尽管天堂鱼中chd在轴旁域的表达转换可能存在异时性变化。视网膜发育关键基因rx3在体节发生早期在两物种的眼域均显示表达。中胚层标志基因tbxta在70%原肠胚阶段的胚环和胚胎盾均有表达，在体节发生阶段均标记脊髓和尾芽。生肌调节因子myod1在体节发生阶段均在轴旁中胚层区域标记发育中的体节。而参与肾脏、眼、耳和神经系统发育的pax2a在12体节阶段在两物种的前眼、中脑、耳腔和肾原基区域均显示相似表达模式。这些结果表明，这些关键发育基因在天堂鱼和斑马鱼中的表达模式高度保守，反映了它们在硬骨鱼类发育中的核心作用。

信号通路调控的发育效应

研究进一步通过小分子抑制剂探讨了BMP、Wnt、Shh和Notch信号通路在天堂鱼早期发育中的作用。BMP信号通路抑制实验显示，使用dorsomorphin处理早期胚胎导致两物种均出现背化表型，神经板扩张，pax2a表达域扩大。Wnt信号通路激活实验表明，氯化锂处理导致两物种在体节发生阶段均缺乏rx3表达，并在2天受精后出现无眼表型，但天堂鱼需要更长的处理时间(30分钟)才能达到与斑马鱼(10分钟)相同的表型。Shh信号通路抑制实验显示，cyclopamine处理引起两物种胚胎身体弯曲、眼距过近和C形体节等典型表型。Notch信号通路抑制实验发现，DAPT处理导致体节边界形成异常，其中天堂鱼幼体出现更明显的躯干和尾部变形。这些结果证实了这些保守信号通路在天堂鱼和斑马鱼早期发育中具有相似功能。

研究结论与意义

本研究成功优化了适用于天堂鱼的全胚胎原位杂交技术，解决了该物种分子生物学研究的关键技术瓶颈。通过比较天堂鱼与斑马鱼的基因表达模式和信号通路功能，证实了脊椎动物早期发育程序的进化保守性。这一技术平台的建立为利用天堂鱼研究物种特异性特征(如迷器发育)和行为差异的分子基础提供了重要工具。研究表明天堂鱼胚胎绒毛膜对小分子试剂具有通透性，这为其在药物筛选和毒理学研究中的应用提供了可能。结合近期发布的天堂鱼基因组数据，这些方法学进展将推动天堂鱼作为补充模式生物在进化发育生物学和生物医学研究中的广泛应用，特别在探索进化创新起源和遗传-行为关联等前沿科学问题方面具有独特价值。