pH依赖性绿色荧光蛋白的光物理与光谱特性研究及其在气道表面液体pH传感中的应用

《Physiological Reports》：The pH-dependent photophysical and spectral properties of pH-sensing green fluorescent proteins

本文系统研究了pHluorins和sfGFP等绿色荧光蛋白（GFP）变体的光物理特性（如消光系数ε和量子产率Φ）及其pH依赖性光谱行为，并成功开发新型pH传感器pHluorin4。研究通过比较不同pH条件下各探针的亮度（brightness）和pKa值，验证了pHluorin4在囊性纤维化（CF）与非CF气道上皮细胞模型中对气道表面液体（ASL）pH差异的高效报告能力，为优化生物系统中pH传感探针的应用提供了重要数据支持。

　　

引言

质子（H⁺）通过质子化和去质子化反应显著影响生物分子功能。尽管细胞质和多数器官通过缓冲系统和转运体维持pH稳定，但器官腔隙（如气道表面液体，ASL）的pH可能存在显著差异。传统微电极虽精度高，但存在技术局限，促使荧光pH传感器的应用。尽管已有多种基于绿色荧光蛋白（GFP）的pH传感器被报道，但其数据多限于光谱特性，光物理特性常仅针对单一pH值报道。本研究旨在系统比较pHluorins和超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）的光物理特性，并评估新型传感器pHluorin4在囊性纤维化（CF）与非CF上皮细胞ASL pH报告中的应用潜力。

方法

通过合成cDNA片段并克隆至表达载体，构建了sfGFP、pHluorin2、pHluorin3、pHluorin4及sfGFP-mCRISPRed等探针。探针在A549细胞中表达，并通过大肠杆菌系统纯化获得麦芽糖结合蛋白（MBP）融合蛋白。利用光谱仪测定各探针在不同pH值（5.47~8.00）下的消光系数（ε）和量子产率（Φ），计算分子亮度（ε×Φ）。通过滴定曲线拟合pK_a值，并采用比率法（如400 nm/440 nm激发比率）评估pH敏感性。最后，将纯化探针添加至原代人气道上皮细胞的ASL中，通过荧光显微镜测量CF与非CF模型在福斯高林刺激下的ASL pH差异。

结果

GFP在A549细胞中的表达

新型嵌合体pHluorin4可在哺乳动物细胞中成功表达，而另一嵌合体未能表达（图2）。pHluorin4的命名基于此前已报道的sfGFP-pHluorin2（即pHluorin3）。序列比对显示，pHluorin4包含S65T、E132D、S147E、N149L、N164I、K166Q、I167V、R168H、S202H和L220F等关键突变（表3）。

pH敏感荧光团的光物理特性

sfGFP在490 nm激发、pH 8.00条件下测得ε=46,000 M^?1·cm^?1，Φ=0.62，亮度pK_a为6.03（图3d）。pHluorins均显示双激发峰（~400 nm和~490 nm），但亮度均低于sfGFP。pHluorin2和pHluorin4在440 nm/400 nm激发比率变化最大，适用于比率成像（图4）。pHluorin4的pK_a约为7.0，其酚盐阴离子形式在酸性条件下亮度更高，可能由132、161和220位氨基酸的氢键网络优化所致。

sfGFP-mCRISPRed的构建

为赋予sfGFP比率传感能力，将其与低pK_a荧光团mCRISPRed融合。mCRISPRed的亮度（13,110 M^?1·cm^?1）显著高于LSSmKate2（4,420 M^?1·cm^?1），且光漂白特性相似（图5），故选择mCRISPRed作为sfGFP的伴侣探针。

ASL pH测量的探针优化

MBP融合探针的内毒素水平符合实验要求（图6a）。通过蔗糖调整粘度模拟ASL环境，所有探针在粘度升高时仍保持90%以上荧光强度（图6b-e），表明粘度对比率pH测量影响可忽略。

MBP融合pH传感器测量ASL pH

将1 μM探针加入ASL过夜孵育后，pHluorin4和sfGFP-mCRISPRed均能检测到福斯高林刺激下非CF与CF上皮的ASL pH差异（图6f）。但sfGFP-mCRISPRed的测量变异性较高，可能因mCRISPRed通道信噪比低所致。

讨论

本研究首次系统报道了pHluorins和sfGFP在不同pH和波长下的光物理特性。pHluorin4的pK_a~7.0，适用于细胞质和轻度酸性腔隙（如ASL）的pH传感。其双激发特性源于GFP酚和酚盐阴离子形式的共存，而S65T突变在pHluorin4中可能导致折叠异常，反而降低488 nm激发下的荧光。

与sfGFP-mCRISPRed相比，pHluorin4的单探针比率设计降低了噪声，但MBP融合探针的制备流程复杂且需内毒素控制。未来可通过优化mCRISPRed亮度或开发单色团pH传感器进一步提升性能。pHluorin4可通过遗传编码靶向特定细胞区室，拓展其在动态pH监测中的应用。