NNMT抑制通过改善肌肉功能而非血流恢复增强外周动脉疾病缺血肢体功能

《Physiological Reports》：Nicotinamide N-methyltransferase inhibition improves limb function in experimental peripheral artery disease

本研究揭示外周动脉疾病（PAD）患者骨骼肌中烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）表达上调，并通过小鼠后肢缺血模型证实，抑制NNMT可显著改善缺血肌肉力量、功率输出和总做功能力，且该改善作用独立于血流灌注变化，为PAD的肌肉靶向治疗提供了新策略。

　　

1 引言

外周动脉疾病（PAD）是动脉粥样硬化性心血管疾病的一种形式，其下肢血流减少导致行走能力受损，并增加截肢和死亡风险。尽管抗血小板、抗血栓和降胆固醇药物在降低心血管事件死亡率方面取得了巨大进展，但改善PAD患者下肢功能或行走能力的治疗方法仍然有限。除了西洛他唑（一种诱导血管扩张的磷酸二酯酶抑制剂）外，只有监督下的运动疗法被证明可以改善PAD患者的行走表现。越来越多的证据表明，PAD患者存在显著的骨骼肌病理变化，但目前尚无改善PAD患者肌肉健康和功能的治疗方法。

PAD患者下肢骨骼肌代谢受损已被充分证实，这些发现将焦点集中在PAD中的肌肉线粒体上。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是一种重要的辅酶，参与氧化还原反应、线粒体功能以及调节肌肉健康和再生的信号通路。在骨骼肌中，NAD⁺水平随着年龄增长、损伤和代谢应激而下降，从而损害sirtuins和其他NAD⁺依赖性酶的功能，这些酶对线粒体生物发生、干细胞维持和修复至关重要。在PAD的背景下——衰老、废用和缺血性损伤汇聚于此——提高NAD⁺可用性可能通过改善线粒体功能和代谢弹性来支持肌肉再生。

本研究发现在PAD患者的骨骼肌中，参与烟酰胺甲基化的烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）表达显著更高，该酶使烟酰胺偏离NAD⁺补救途径。因此，本研究旨在测试使用NNMT抑制剂治疗是否能改善实验性PAD小鼠的肢体功能。

2 方法

2.1 人类肌肉分析

利用先前发表的RNA测序数据集，分析了无PAD（非PAD）和严重PAD（慢性威胁肢体缺血，CLTI）患者腓肠肌中参与NAD⁺稳态的基因表达。在一个独立的非PAD和严重PAD患者队列中，通过蛋白质组学分析量化了NNMT的蛋白表达。

2.2 单细胞RNA测序分析

分析了一个公开的单细胞RNA测序数据集，比较了缺血耐受型C57BL6J和缺血敏感型BALB/cJ小鼠品系在后肢缺血手术后多个时间点肌肉干细胞中Nnmt的表达。

2.3 动物

实验在12周龄雄性BALB/cJ小鼠上进行。

2.4 外周动脉疾病动物模型

通过股动脉结扎术诱导单侧后肢缺血，建立PAD模型。

2.5 安慰剂和NNMTi治疗

使用从MedChemExpress获得的NNMT抑制剂，通过腹腔注射给予小鼠。安慰剂对照涉及等体积的DMSO用盐水稀释。NNMTi以10 mg/kg的剂量，在HLI手术前3小时开始给药，之后每天一次。

2.6 肢体灌注评估

使用高分辨率激光多普勒成像仪测量肢体灌注恢复情况。

2.7 神经介导的等长肌肉收缩

使用离体全动物系统测量跖屈肌的功能测试，通过刺激坐骨神经引发肌肉收缩。

2.8 6分钟肢体功能测试

通过后加载等张收缩评估一系列重复收缩中的肌肉性能，量化力量、位移、缩短速度、机械功率和机械功。

2.9 免疫荧光显微镜

肌肉组织切片用于标记层粘连蛋白和毛细血管，分析毛细血管密度和肌纤维横截面积，并量化胚胎肌球蛋白重链阳性纤维。

2.10 RNA分离和定量聚合酶链反应

从肌肉中提取总RNA，进行cDNA合成和定量PCR，分析相关基因表达。

2.11 免疫印迹

使用蛋白质印迹法检测肌肉线粒体复合物亚基的相对水平。

2.12 统计分析

数据以平均值±标准差表示。使用适当的统计检验进行比较，p < 0.05认为有统计学意义。

3 结果

3.1 NAD⁺补救途径在PAD患者肌肉中失调

RNA测序分析显示，与无PAD者相比，CLTI患者肌肉中NNMT的mRNA表达显著更高，而NAMPT、NMRK和NMNAT的表达显著下调。蛋白质组学分析证实，CLTI患者肌肉中NNMT的蛋白丰度也显著高于非PAD对照组。

3.2 NNMT表达在缺血敏感型BALB/cJ小鼠的肌肉干细胞中持续升高

单细胞RNA测序分析显示，后肢缺血手术后，两种品系小鼠的肌肉干细胞均上调Nnmt表达，但仅在BALB/cJ小鼠的肌肉干细胞中观察到持续的高表达。

3.3 NNMT抑制不改变雄性实验性PAD小鼠的灌注恢复或毛细血管密度，但可能减少坏死

激光多普勒灌注成像显示，NNMTi对后肢缺血后的灌注恢复没有显著影响。缺血肌肉中的毛细血管总数和每肌纤维毛细血管数量在治疗组之间无差异。NNMTi治疗组小鼠足部坏死的严重程度与安慰剂组无显著差异。

3.4 NNMT抑制不改变雄性实验性PAD小鼠的肌肉质量或肌纤维面积

NNMTi治疗对缺血和非缺血腓肠肌的质量均无影响。平均肌纤维横截面积的组织学分析也显示NNMTi治疗对肌纤维大小无影响。缺血肌肉中表达胚胎肌球蛋白的肌纤维数量无差异。mRNA分析显示，与安慰剂组相比，NNMTi治疗组小鼠缺血肌肉中Ppargc1a和Sirt3的表达显著更高。但线粒体复合物蛋白亚基的定量表明缺血肌肉中的蛋白丰度无差异。

3.5 NNMT抑制显著改善雄性实验性PAD小鼠的肌肉力量、功率和总功

离体评估显示，NNMTi治疗显著改善了肌肉的绝对力量和比力。使用30%最大等长力量的等张缩短收缩，NNMTi治疗组小鼠表现出显著更高的肌肉功率输出。在6分钟肢体功能测试中，NNMTi治疗组小鼠在测试过程中完成了显著更多的肌肉功，总做功量也显著高于安慰剂组。测试期间观察到的充血有增加趋势但不显著。

4 讨论

改善PAD患者下肢功能的治疗选择有限。本研究发现PAD患者腓肠肌中NNMT表达升高，NNMT是一种削弱NAD⁺补救途径的酶。基于此，我们测试了NNMT抑制是否能改善PAD小鼠模型的缺血肢体功能。NNMT抑制改善了肌肉力量、质量和做功输出。值得注意的是，这些肌肉性能的改善是在灌注或毛细血管密度无显著差异的情况下发生的，表明NNMTi对肌肉细胞有直接作用，从而产生治疗效果。

本研究结果与其他临床前啮齿类模型中使用NNMTi观察到的治疗效果一致。例如，在衰老小鼠中使用NNMTi改善了握力。除了NNMT，其他研究也提供了证据表明，通过NR治疗或NAMPT的基因操作来调节NAD⁺补救途径，可以在多种条件下显著增强肌肉功能。

最近一项针对90名PAD患者的随机临床试验报告称，NR补充显著改善了行走性能。这一令人兴奋的结果凸显了NAD⁺调节疗法在改善PAD下肢功能方面的潜力。我们在临床前PAD模型中的结果表明NNMTi改善了肢体功能，但未检查NR补充的效果。未来的研究应考虑将NNMTi治疗与烟酰胺补充相结合以增强治疗效果。除了药物治疗，运动是另一种被证明可以增强NAD稳态的方法，并且是少数被证明可以改善PAD患者行走表现的可用治疗方法之一。因此，一个有前景的途径可能是将NAD调节治疗与运动训练相结合，以促进PAD的下肢功能。

本研究存在一些局限性。首先，所使用的临床前PAD模型仅使用了雄性BALB/cJ小鼠，该品系对肢体缺血敏感，不能充分代表PAD的全部谱系。未来需要在患有实验性PAD的雌性小鼠中测试NNMTi的疗效。其次，后肢缺血的急性性质不能模拟人类PAD最常见的进行性动脉粥样硬化疾病发展。最后，本研究未测量NAD⁺水平。我们选择不测量NAD代谢物是因为进行6分钟肢体功能测试可能对测量结果产生影响。因此，NNMTi在本研究中观察到的有益效果不能直接与NAD⁺稳态联系起来，其他可能的脱靶效应可能有助于观察到的肌肉功能改善。最后，本研究未包括假手术组，因此无法量化后肢缺血诱导的NAD失调程度。

总之，本研究提供的证据表明，NNMT抑制改善了患有实验性PAD的雄性小鼠的缺血肢体功能。肢体功能的改善发生在肢体灌注无相应变化的情况下，表明NNMTi不直接或间接影响缺血性血管生成。