CRISPR/Cas9介导糖生物碱通路基因编辑创制无糖生物碱淀粉马铃薯及副产物可持续利用研究

《Plant Biotechnology Journal》：Glycoalkaloid-Free Starch Potatoes Generated by CRISPR/Cas9-Mediated Mutations of Genes in the Glycoalkaloid Biosynthesis Pathway Enable More Sustainable Uses of By-Products From Starch Production

本文报道了利用DNA-free CRISPR/Cas9技术对淀粉马铃薯品种"Kuras"中甾体糖生物碱（SGA）生物合成通路的关键基因进行定向编辑，成功获得SGA含量显著降低的突变体。研究靶向胆固醇合成前（SMO1-L、DWF1-L、DWF7-L）及合成后（16DOX、CYP88B1、TAMiso2）的6个关键基因，通过温室和田间试验验证突变体农艺性状及SGA水平。结果表明，多个纯合敲除突变体在叶片和块茎中均实现近乎无SGA表型，且其淀粉加工副产物（纤维和蛋白）中SGA含量远低于安全限值（150 mg·kg-1），为淀粉工业副产物高值化利用（如食品级蛋白和纤维生产）提供了可持续解决方案。

　　

引言

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是全球第四大粮食作物，其块茎除作为主食外，还是淀粉、饲料、酒精等工业的重要原料。甾体糖生物碱（Steroidal Glycoalkaloids, SGAs）是马铃薯中一类具有毒性的胆固醇衍生次级代谢产物，主要包含α-茄碱（α-solanine）和α-卡茄碱（α-chaconine）。块茎中SGA含量过高不仅威胁鲜食安全，也阻碍淀粉加工副产物（如果汁和薯渣）作为食品或饲料的再利用。目前，马铃薯淀粉加工副产物中SGA会结合蛋白质和纤维，导致其难以安全利用。传统育种因马铃薯四体遗传和高杂合性而效率低下，现代基因编辑技术如CRISPR/Cas9为创制低SGA马铃薯提供了新途径。

突变体创制与筛选

研究采用DNA-free CRISPR/Cas9技术，针对SGA生物合成通路中胆固醇合成前通路基因（SMO1-L、DWF1-L、DWF7-L）和胆固醇后修饰基因（16DOX、CYP88B1、TAMiso2）设计sgRNA，通过原生质体转染RNP复合体并再生植株。编辑效率在20%–49%之间，通过高分辨率片段分析（HRFA）和Sanger测序验证突变类型。根据等位基因编辑状态将突变事件分为三类：第1类（所有等位基因移码突变，纯合敲除）、第2类（所有等位基因突变但至少一个为框内突变）和第3类（存在未编辑野生型等位基因）。初步薄层色谱（TLC）筛选显示，第1、2类突变体中60%–70%的SGA水平显著降低。

突变体表型与SGA积累分析

温室栽培39个突变事件发现，约51%的植株株高显著低于野生型，部分事件（如7d032、9d054）甚至无法存活。块茎产量降低27%–87%，但生长抑制与SGA水平无显著相关性，表明表型变异可能源于体细胞无性系变异或其他因素。超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）定量分析显示，多数突变体叶片和块茎中总SGA（TGA）含量降至野生型10%以下，其中16DOX突变体几乎完全缺失SGA。经创伤或光照诱导处理（SGA积累条件）后，野生型块茎SGA水平升高约3倍，而突变体无明显增加，证明基因编辑有效阻断了基础及诱导型SGA合成。

甾体代谢谱分析

气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）分析叶片甾体代谢物发现，预胆固醇通路突变体甾体谱变化显著：SMO1-L突变体中环阿屯醇（cycloartenol）、环阿屯醇醇（cycloartanol）和羊毛甾醇（lanosterol）积累，胆固醇水平下降；DWF1-L突变体则伴随C₂₈/C₂₉甾体（如菜油甾醇）含量升高；DWF7-L突变体中胆固醇前体物羽扇豆醇（lathosterol）积累。后胆固醇通路突变体甾体变化较小，但TAMiso2和CYP88B1突变体胆固醇和豆甾醇（stigmasterol）水平降低。结果表明，不同基因编辑对甾体代谢网络的影响具有特异性。

田间试验与副产物安全性评估

田间试验中，7个代表性突变体均出现块茎减产（3%–81%），但SGA水平均低于野生型3%。淀粉加工副产物分析显示，野生型纤维和蛋白组分中SGA含量分别为1132 mg·kg^-1和5791 mg·kg^-1，超过安全限值8倍和40倍；而突变体（如16DOX敲除）副产物中SGA含量降至3.1 mg·kg^-1，仅为安全限值的2%，且与可食用淀粉组分水平相当。这表明低SGA突变体副产物具备直接开发为食品级资源的潜力。

讨论与展望

本研究首次在淀粉马铃薯中通过多基因编辑实现SGA高效降低，其中后胆固醇通路基因（如16DOX）编辑效果尤为显著。突变体SGA降低与抗病虫能力的关系需进一步研究，但田间试验未发现明显病虫害加剧。该策略为淀粉工业副产物高值化利用提供了新范式，有望每年从欧盟750万吨淀粉马铃薯中回收15万吨食品级蛋白，兼具经济与环境效益。未来需通过大田试验优化基因组合，平衡产量、淀粉含量与副产物安全性。