心肌细胞SIRT5缺失通过嘌呤代谢紊乱加速心力衰竭的机制研究

本研究揭示线粒体去酰化酶SIRT5在心脏功能调控中的关键作用：心肌细胞特异性缺失SIRT5会通过转录级联反应破坏嘌呤代谢平衡，导致ATP前体耗竭，加剧压力超负荷诱导的心室重构和功能障碍。该发现为心力衰竭（HF）的能量代谢治疗提供了新靶点。

　　

ABSTRACT

线粒体NAD⁺依赖性去酰化酶Sirtuin 5（SIRT5）通过调控能量代谢等基础细胞通路在心脏生理过程中发挥重要作用。本研究旨在深入探究SIRT5在心力衰竭（HF）发展中的具体作用机制。

方法

研究团队构建了心肌细胞特异性SIRT5敲除（cSirt5^?/?）和过表达（cSirt5-Tg）小鼠模型，并通过横向主动脉缩窄术（TAC）实施慢性压力超负荷干预。采用超声心动图、离体心脏灌流和组织学分析评估心脏结构与功能，结合质谱代谢组学和批量RNA测序技术探索代谢与分子特征。

结果

cSirt5-Tg小鼠与对照组小鼠心脏结构和功能相似，而cSirt5^?/?小鼠在TAC术后表现出加剧的心室扩张和功能障碍（经超声心动图和离体心脏灌流验证）。代谢组学分析显示cSirt5^?/?心脏中肌苷和次黄嘌呤积累，而腺苷、腺嘌呤、AMP和ADP耗竭，表明嘌呤代谢紊乱。RNA测序发现TAC术后cSirt5^?/?心脏中嘌呤核苷磷酸化酶和5′核苷酸酶上调，腺苷激酶（ADK）下调，提示SIRT5缺失导致腺苷核苷酸补救途径与嘌呤降解途径的界面调控失调。对人类心衰患者左心室组织的分析显示SIRT5表达降低与ADK表达减少相关。

结论

心肌细胞SIRT5缺失会加剧慢性压力超负荷引起的心脏重构和功能障碍，这一过程涉及嘌呤代谢转录失调导致的ATP前体耗竭。

Practitioner Points

• 心肌细胞SIRT5缺失会加剧慢性压力超负荷后的心脏重构和功能障碍，伴随腺嘌呤核苷酸耗竭和嘌呤代谢物积累

• SIRT5缺陷通过改变嘌呤代谢酶表达促进嘌呤降解

• 人类衰竭心脏显示SIRT5和腺苷激酶（ADK）表达降低，表明嘌呤代谢受损在心衰发病中具有重要意义

1 引言

Sirtuins（SIRTs）蛋白家族包含7个成员（SIRT1–7），通过调控翻译后修饰和基因转录参与细胞代谢、炎症、基因转录和DNA修复过程。哺乳动物SIRT3、SIRT4和SIRT5定位于线粒体。SIRT3主要具有脱乙酰酶活性，而SIRT5可去除赖氨酸残基上的丙二酰基、琥珀酰基和戊二酰基等酰基基团。SIRT5在人和小鼠心脏中高表达，且心脏中蛋白赖氨酸琥珀酰化程度最高。SIRT5通过调控氧化磷酸化、TCA循环和脂肪酸氧化等关键能量代谢蛋白活性，在心脏能量代谢中发挥重要作用。

心脏收缩和离子泵功能主要依靠氧化能量代谢产生的三磷酸腺苷（ATP）水解维持。心脏ATP约70%来自脂肪酸氧化，其余来自葡萄糖、乳酸、酮体和氨基酸氧化。ATP水解生成二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP），后者可通过嘌呤降解途径转化为腺苷、一磷酸肌苷（IMP）和次黄嘌呤。健康条件下，嘌呤核苷酸合成、降解和补救途径保持平衡。然而，心衰的一个标志是心肌ATP水平和转换率降低，导致无法满足衰竭心脏的能量需求。嘌呤合成中间体耗竭和降解产物积累也在心衰中被观察到，特别是腺嘌呤核苷酸池减少与收缩功能恶化密切相关，表明嘌呤核苷酸平衡失调可能在心衰发展中起重要作用。

心脏收缩力由肌动蛋白-肌球蛋白网络和高效能量代谢系统精细调控。心肌细胞在应对后负荷增加和心衰发展过程中的能量需求增加时至关重要。为阐明SIRT5在心脏功能和能量代谢中的作用，本研究探索心肌细胞SIRT5水平改变如何影响压力超负荷诱导的心肌肥厚和心衰模型的心脏功能与结构，并采用无偏代谢组学和转录组学分析潜在机制。

2 材料与方法

2.1 动物与处理

实验遵循美国国立卫生研究院《实验室动物护理与使用指南》，并获得相关机构批准。Sirt5^?/?小鼠由瑞士洛桑联邦理工学院提供，Sirt5-Tg小鼠由美国密歇根大学提供。通过与心肌细胞特异性表达Cre重组酶小鼠（Myh6-cre）杂交，获得心肌细胞特异性Sirt5敲除（cSirt5^?/?）和过表达（cSirt5-Tg）小鼠。研究使用雄性小鼠，非表达Cre重组酶的转基因小鼠作为对照。

2.2 代谢组学

采用珠磨均质器分散冷冻心脏组织，使用Bligh-Dyer法提取代谢物，通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）分析代谢谱，使用MS-DIAL和MetaboAnalyst软件进行数据处理。

2.3 RNA测序分析

使用RNeasy Tissue Mini Kit提取心脏总RNA，Illumina HiSeq2000进行测序。采用STAR软件将读数比对到小鼠基因组，使用DESeq2进行差异基因表达分析，通过EnrichR进行通路富集分析，Cytoscape构建蛋白质相互作用网络。

2.4 人类基因表达数据

人类样本研究经医学大学伦理委员会批准，采用死后 explant 心脏左心室游离壁样本，包括22例非心衰患者和14例缺血性或非缺血性扩张型心肌病伴严重射血分数降低的心衰患者。

2.5 统计分析

数据以均值±标准误表示，使用GraphPad Prism软件进行统计分析。两组比较采用F检验和t检验，多组比较采用双因素方差分析（ANOVA）和Fisher's LSD检验。

3 结果

3.1 心肌细胞特异性SIRT5缺失加剧压力超负荷后心脏功能障碍和重构

成功构建cSirt5^?/?小鼠模型，其心脏丙二酰化和琥珀酰化水平升高。TAC术后，cSirt5^?/?小鼠死亡率增加，射血分数（EF）进一步降低，左心室内径（LVID）和收缩末期容积（ESV）增加，心室壁增厚不明显。心脏重量和心肌细胞尺寸增大，胶原含量增加。离体工作心脏灌流显示cSirt5^?/?心脏心输出量、心脏功率、心脏功和心脏效率均恶化。表明心肌细胞SIRT5缺失加剧慢性压力超负荷引起的心脏功能障碍和扩张性重构。

3.2 心肌细胞特异性SIRT5过表达不影响压力超负荷后心脏功能障碍和重构

cSirt5-Tg小鼠心脏SIRT5蛋白表达增加10倍，但琥珀酰化和丙二酰化水平无变化。TAC术后，cSirt5-Tg与对照组小鼠EF下降程度相似，LVID和ESV轻微增加，心脏重量、心室壁厚度、心肌细胞尺寸和心肌纤维化程度无显著差异。表明心肌细胞SIRT5过表达不影响压力超负荷引起的心脏功能障碍和重构。

3.3 心肌细胞特异性SIRT5过表达不增加压力超负荷后心肌脂质过氧化

评估氧化应激显示，cSirt5^?/?心脏总心肌和线粒体4-羟基壬烯醛（4-HNE）水平无变化，丙二醛（MDA）水平降低。抗氧化基因表达分析显示超氧化物歧化酶2（Sod2）和过氧化氢酶（Cat）无差异，但硫氧还蛋白1（Trxn1）、过氧化物酶3（Prdx3）、谷胱甘肽过氧化物酶1和4（Gpx1, Gpx4）表达显著升高。表明尽管抗氧化基因表达增加提示ROS解毒增强，但脂质过氧化未增加说明心脏ROS稳态得以维持，可能不是SIRT5缺失加剧心脏功能障碍的主要原因。

3.4 心肌细胞特异性SIRT5缺失抑制压力超负荷后心肌基因表达变化

RNA测序分析显示，对照组心脏TAC术后出现1786个差异表达基因（DEGs），而cSirt5^?/?心脏仅293个DEGs，表明cSirt5^?/?心脏对TAC诱导的基因表达变化反应受损。通路富集分析显示，对照组心脏TAC术后上调的DEGs主要与胶原纤维形成和细胞外基质重构相关，下调的DEGs与线粒体脂肪酸氧化（FAO）和支链氨基酸代谢相关。而cSirt5^?/?心脏中FAO抑制消失，提示SIRT5可能是压力超负荷后代谢重编程所必需的。

3.5 心肌细胞特异性SIRT5缺失失调压力超负荷后心肌嘌呤代谢

代谢组学分析显示，cSirt5^?/?心脏中嘌呤降解中间体肌苷和次黄嘌呤积累，而腺苷、腺嘌呤、AMP和ADP耗竭。RNA测序发现嘌呤代谢相关基因（Nt5e, Pnp, Aprt, Hprt, Adk, Gns）和嘧啶代谢基因（Dpyd, Upp1）表达失调。其中5′核苷酸酶（Nt5e）和嘌呤核苷磷酸化酶（Pnp）表达增加可能介导嘌呤降解增强，而腺苷激酶（Adk）表达减少可能损害腺苷核苷酸补救。ADK蛋白表达也显著降低。表明SIRT5缺陷诱导嘌呤降解和腺苷核苷酸补救界面酶的转录失调，损害ATP再生和心脏能量代谢。

3.6 人类衰竭心脏中SIRT5和ADK表达降低

对人类心衰患者左心室组织分析显示，心衰患者EF显著降低（26%±10% vs 63%±6%），SIRT5蛋白和mRNA表达分别降低29%和36%，总琥珀酰化水平无变化。ADK基因和蛋白表达显著降低，且ADK表达与SIRT5表达呈正相关。表明SIRT5水平降低可能驱动ADK下调，加剧心肌能量耗竭促进心衰进展。

4 讨论

本研究通过心肌细胞特异性SIRT5敲除和过表达模型，揭示SIRT5在心脏适应能量需求增加中的关键作用。结果表明心肌细胞SIRT5缺失加剧慢性压力超负荷引起的心脏功能障碍，而SIRT5过表达无有害影响。与既往研究一致，全身性SIRT5敲除小鼠出现年龄依赖性心肌肥厚和功能障碍，但产后诱导的心肌细胞特异性SIRT5缺失不影响心脏功能，提示SIRT5缺失的时间点对心脏表型至关重要。

代谢组学发现cSirt5^?/?心脏腺嘌呤核苷酸耗竭和嘌呤代谢物积累，与心衰模型中ATP水平降低一致。腺苷核苷酸耗竭可能通过 impairing AMP激活蛋白激酶（AMPK）和磷酸果糖激酶（PFK）活性，损害糖酵解和氧化能量代谢。协同腺嘌呤核苷酸耗竭和能量需求增加可能损害ATP转换，加剧心脏功能障碍。

与快速右心室起搏模型不同，本研究观察到肌苷和次黄嘌呤积累，伴随NT5E和PNP表达增加。NT5E将AMP水解为腺苷，PNP将肌苷转化为次黄嘌呤，提示其可能 contribute to 嘌呤代谢物积累。心衰患者心肌NT5E表达也增加，其功能后果尚待阐明。ADK表达降低也可能加剧腺苷核苷酸耗竭。表明SIRT5缺陷驱动嘌呤代谢酶的转录失调，损害ATP转换加剧心脏功能恶化。

对人类心衰样本分析显示SIRT5和ADK表达降低，且两者表达相关。心肌细胞特异性Adk^?/?小鼠在慢性压力超负荷下出现心脏肥厚加重和症状性扩张型心肌病，提示ADK下调可能加剧心衰进展。全身性嘌呤代谢物变化也在心衰患者中被观察到，表明SIRT5水平降低可能通过下调ADK加剧心肌能量耗竭促进心衰发展。

5 结论

心肌细胞SIRT5缺失通过转录失调破坏嘌呤代谢平衡，导致ATP前体耗竭，加剧压力超负荷引起的心脏重构和功能障碍。人类衰竭心脏SIRT5和ADK表达降低，提示维持或恢复SIRT5水平可能成为心衰治疗的潜在靶点。