基于游离DNA甲基化的液体活检技术用于T1期胃癌淋巴结转移检测的创新研究

《United European Gastroenterology Journal》：Cell-Free DNA Methylation-Based Liquid Biopsy Assay to Identify Lymph Node Metastasis in T1 Gastric Cancer

本刊推荐：本研究通过全基因组DNA甲基化分析，开发了一种基于游离DNA（cfDNA）甲基化特征的液体活检技术，用于T1期胃癌（GC）术前淋巴结转移（LNM）检测。该技术结合六种新型甲基化标志物和计算机断层扫描（CT）影像特征，构建的组合模型曲线下面积（AUC）达0.86，可使44%的患者避免不必要的根治性切除术，且不遗漏LNM阳性病例，为胃癌精准治疗提供了突破性策略。

　　

背景

T1期胃癌（GC）指肿瘤局限于黏膜或黏膜下层的早期胃癌，虽然其淋巴结转移（LNM）发生率低于20%，但术前准确诊断LNM仍是临床难点。目前计算机断层扫描（CT）等影像学手段的假阴性率高达40%–50%，导致大量无LNM的患者接受不必要的根治性胃切除术及淋巴结清扫，引发营养缺乏和倾倒综合征等术后并发症。根据日本胃癌协会（JGCA）和欧洲胃肠内镜学会（ESGE）指南，符合特定条件的T1期胃癌可通过内镜切除实现根治，但现行组织学治愈标准过于严格，致使约80%的实际无LNM患者接受过度治疗。因此，开发术前精准识别LNM的生物标志物至关重要。

DNA甲基化作为表观遗传标志物，在肿瘤发生和转移早期即出现异常，且能通过血液中的游离DNA（cfDNA）进行无创检测。本研究通过全基因组甲基化分析，筛选出与LNM相关的特异性甲基化标志物，并转化为定量甲基化特异性PCR（qMSP）检测体系，最终构建用于T1期胃癌LNM风险评估的液体活检模型。

研究方法

研究纳入277例临床样本，包括177例福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）手术组织（训练队列108例、验证队列69例）和100例术前血浆样本（性能评估队列）。通过分析癌症基因组图谱（TCGA）数据库中98例T1–2期胃癌的450K甲基化芯片数据，筛选差异甲基化CpG位点（│Δbeta│ > 0.12且p < 0.05），并定义100 bp内至少含2个差异甲基化CpG的区域为差异甲基化区域（DMRs）。最终鉴定出6个DMRs（涉及11个CpG位点），其组合在TCGA队列中检测LNM的曲线下面积（AUC）为0.78。

采用qMSP检测临床样本中DMRs的甲基化水平，以甲基化参考百分比（PMR）量化。通过多变量逻辑回归分析构建DNA甲基化模型，并联合术前CT影像特征建立组合模型。模型性能通过受试者工作特征（ROC）曲线、校准曲线和决策曲线分析（DCA）评估。

研究结果

基因组标志物发现阶段，6个DMRs位于PAQR6、HLX、HIST1H4F和FUZ等基因的启动子或增强子区域。在FFPE训练队列中，DNA甲基化模型检测LNM的AUC为0.80，显著优于单一临床病理指标。在独立验证队列中，DNA甲基化模型AUC为0.73，而联合CT特征的组合模型AUC提升至0.84，且多变量分析显示其为LNM的独立预测因子（比值比[OR]=15.10）。

液体活检验证中，组合模型在cfDNA样本中仍保持优异性能（AUC=0.87），校准曲线显示预测概率与实际LNM发生率高度一致。在T1期胃癌亚组中，模型AUC达0.86，灵敏度70%、特异性95%、阳性预测值（PPV）64%、阴性预测值（NPV）96%。决策曲线分析表明，该模型在所有风险阈值下均比现行临床策略（全部手术）具有更高净收益。

临床意义分析显示，若术前应用该模型，87%的T1期胃癌患者（74/85）可被划分为低风险组并推荐内镜切除，其中50%患者经组织学评估符合JGCA内镜治愈标准，且无LNM漏诊；同时，44%的患者可避免不必要的根治性手术，且所有LNM阳性患者均被正确识别。

讨论与展望

本研究通过系统性生物标志物开发流程，首次将DNA甲基化标志物成功转化为T1期胃癌LNM检测的液体活检 assay。其创新性在于：1）基于全基因组甲基化图谱筛选DMRs，提高标志物可靠性；2）通过qMSP实现技术简化，利于临床推广；3）组合CT影像特征弥补了单一甲基化标志物的局限性；4）在cfDNA中验证模型性能，突破术前标本应用瓶颈。

局限性包括回顾性单中心设计、样本来源单一（日本人群），且未在独立血液队列中验证。未来需通过多中心前瞻性试验优化模型阈值，并验证其在东西方人群中的普适性。本研究为T1期胃癌的个体化治疗提供了无创决策工具，有望显著改善患者生活质量和治疗效果。

结论

本研究成功开发了一种基于cfDNA甲基化特征的液体活检诊断技术，可无创、精准地术前识别T1期胃癌的淋巴结转移，为减少过度治疗和推动精准医疗提供了新策略。