PALB2 WD40结构域的突变研究揭示了在与BRCA2及DNA修复机制相互作用方面存在缺陷的变异体

《Journal of Bodywork and Movement Therapies》：Mutagenesis of the PALB2 WD40 domain identifies variants defective in interaction with BRCA2 and DNA repair

本研究系统评估了78个PALB2 WD40结构域的错义变异体对BRCA2结合、亚细胞定位及同源重组修复（HDR）功能的影响。通过 mammalian two-hybrid 和荧光显微技术，发现9个变异体（p.Gly971Arg等）在所有功能实验中均显示严重缺陷，其BRCA2结合活性低于5%，亚细胞定位异常且HDR效率显著降低，与已知的致病性突变机制一致。这些变异体被提议作为致病性变异，为临床遗传咨询提供了新的分类依据。

　　PALB2，全称为Partner and Localizer of BRCA2，是一种重要的肿瘤抑制基因，其在遗传性癌症风险评估中扮演着关键角色。该基因编码的蛋白质在维持基因组完整性方面发挥核心作用，尤其是在同源重组（Homologous Recombination, HR）修复过程中。HR是细胞修复DNA双链断裂（Double-Strand Breaks, DSBs）的一种关键机制，对于维持DNA的稳定性至关重要。当PALB2发生功能丧失的变异时，可能会显著增加个体患乳腺癌、卵巢癌以及胰腺癌的风险。然而，大多数PALB2的错义变异（Missense Variants）目前在ClinVar数据库中被归类为“临床意义不确定的变异”（Variants of Uncertain Significance, VUS）或具有矛盾分类，这使得准确评估这些变异的临床影响变得极具挑战性。

本研究通过系统评估78个在ClinVar中报告的PALB2 WD40结构域的错义变异，旨在探索这些变异对PALB2功能、其与BRCA2的相互作用以及癌症风险的具体影响。WD40结构域是PALB2蛋白的一个关键区域，它通过与BRCA2的N端结合，促进BRCA2在DNA损伤部位的募集，从而发挥HR修复的关键作用。研究团队利用多种功能实验方法，包括哺乳动物双杂交（Mammalian Two-Hybrid, M2H）分析、亚细胞定位研究以及HR修复能力测试，来评估这些变异对PALB2功能的潜在影响。

研究结果表明，某些PALB2 WD40结构域的错义变异显著影响其与BRCA2的结合能力，进而导致HR修复效率的下降。例如，有9个变异在所有测试中均表现出功能丧失的特征，包括极低的BRCA2结合活性（<5%）、显著的亚细胞定位异常（如在细胞质中积累）以及HR修复能力的严重缺陷。这些变异在功能上的表现与已知的功能丧失突变相似，如p.Trp1038Ter（一种截断变异）和p.Thr1030Ile（一种非天然的失活变异）。这些发现提示，这些变异可能代表了具有临床意义的致病性变异，尤其是在癌症风险方面。

研究还发现，某些变异虽然在BRCA2结合方面表现轻微，但在HR修复中仍能维持一定的功能。这表明，尽管这些变异可能对BRCA2的结合产生影响，但它们可能通过其他机制影响HR修复过程，或者在更复杂的蛋白质相互作用网络中具有一定的补偿效应。此外，研究团队还发现，某些变异可能暴露了隐藏的核输出信号（Nuclear Export Signal, NES），导致PALB2在细胞质中积累，进而影响其在细胞核中的功能。这种结构上的改变可能对HR修复产生深远的影响，因为PALB2在细胞核中的存在对于其发挥修复功能至关重要。

在实验方法上，研究团队采用了多种技术手段来确保结果的可靠性。例如，哺乳动物双杂交实验用于评估PALB2与BRCA2的相互作用，而亚细胞定位分析则通过荧光显微镜观察这些变异在细胞中的分布情况。HR修复能力的评估则采用了一种基于GFP报告系统的实验方法，通过检测DNA损伤修复后的GFP功能恢复情况来衡量HR效率。这些实验方法不仅提供了对PALB2功能影响的详细数据，还为理解不同变异的临床意义提供了重要依据。

研究中还发现，不同实验方法之间存在一定的相关性，但并非完全一致。例如，BRCA2结合活性与亚细胞定位之间的关系呈现出线性相关（R2 = 0.73），而与HR修复效率之间的关系则为对数相关（R2 = 0.67）。这种相关性的差异提示，虽然BRCA2结合是HR修复的关键环节，但其他因素，如蛋白质稳定性、结构变化以及与其他蛋白的相互作用，也可能在HR修复过程中起到重要作用。因此，仅依赖单一实验方法可能不足以全面评估PALB2变异的临床意义。

此外，研究团队还注意到，不同实验条件下的蛋白质表达水平存在显著差异。这可能与实验中使用的构建体设计、表达载体以及转染方法有关。例如，在BRCA2结合实验中，PALB2变异通常以C端片段的形式表达，而在亚细胞定位实验中，全长度的PALB2蛋白被融合到GFP上进行表达。这种差异可能导致不同实验之间对蛋白质稳定性评估的不一致，进而影响对变异功能影响的判断。因此，在进行临床分类时，需要综合考虑多种实验结果，并谨慎对待单一实验的结论。

研究还强调了当前对PALB2变异的临床评估中存在的挑战。由于大多数错义变异尚未经过充分的功能验证，因此在遗传咨询和癌症筛查中，准确判断这些变异的致病性仍是一个难题。然而，本研究的结果为这一问题提供了新的视角，即某些变异虽然在传统分类中被视为VUS，但其功能影响可能远比预期更为严重。这些变异可能具有“部分功能丧失”（Hypomorphic）的特征，即它们在一定程度上影响了PALB2的功能，但并未完全失活，这可能意味着它们与癌症风险之间的关系需要更深入的分析。

在讨论部分，研究团队进一步探讨了这些变异的潜在机制。例如，一些变异可能通过破坏PALB2的结构稳定性，导致其在细胞质中积累，从而影响其在细胞核中的功能。而另一些变异则可能通过影响PALB2与RAD51的相互作用，进而影响HR修复的效率。这些发现表明，PALB2的功能不仅仅是通过与BRCA2的直接结合实现的，还涉及多个蛋白质之间的复杂相互作用网络。

总体而言，这项研究为理解PALB2错义变异的功能影响提供了重要的证据，并为未来对这些变异的临床分类提供了新的思路。研究结果表明，某些在ClinVar中被标记为VUS或具有矛盾分类的变异，实际上可能具有显著的致病性，特别是在乳腺癌和卵巢癌的风险方面。因此，进一步的功能研究和临床验证对于准确评估这些变异的临床意义至关重要。未来的研究需要结合更多的实验数据和临床信息，以建立更精确的变异分类标准，从而为癌症高风险人群提供更有效的遗传咨询和筛查策略。