StayRose：一种通过遗传密码扩展实现红移的光稳定StayGold衍生荧光蛋白

《Journal of Bodywork and Movement Therapies》：StayRose: a photostable StayGold derivative red-shifted by genetic code expansion

本研究针对荧光蛋白在显微成像中易发生光漂白的问题，开发了基于遗传密码扩展技术的新型红色荧光蛋白StayRose。研究人员通过将StayGold色氨酸Y58位点替换为非天然氨基酸3-氨基酪氨酸(3-aminotyrosine)，成功实现了荧光光谱红移（激发/发射峰：530/588 nm），并保持了优异的光稳定性。该突破为多靶点长时间成像研究提供了重要工具，相关成果对荧光显微技术发展具有显著推动作用。

　　

在生物医学研究领域，荧光蛋白作为重要的分子标记工具，彻底改变了科学家对生命过程的观测方式。然而，传统荧光蛋白在长时间显微成像中存在一个致命缺陷——光漂白（photobleaching）现象。当荧光分子在激光持续照射下发生不可逆的化学降解时，信号强度会逐渐衰减，最终导致图像质量下降甚至信号完全消失。这个长期困扰研究人员的技术瓶颈，严重限制了长时间动态观测实验的开展。

近年来，一种名为StayGold的绿色荧光蛋白引起了科学界的广泛关注。这种从海洋生物Cytaeis uchidae中分离出来的荧光蛋白，展现出非凡的光稳定性，其光漂白速率比常规荧光蛋白低数个数量级。但StayGold本身存在两个局限性：一是其发射光谱位于绿色波段，限制了与其他荧光蛋白的复用能力；二是天然形式为二聚体，可能影响融合蛋白的定位和功能。因此，开发不同颜色的StayGold衍生变体，特别是红移版本，成为领域内的重要研究方向。

在《Journal of Bodywork and Movement Therapies》最新发表的研究中，Warwick大学的研究团队报告了一项突破性进展：他们成功开发出StayRose——一种通过遗传密码扩展技术实现红移的光稳定荧光蛋白。这项研究不仅解决了荧光蛋白的光漂白问题，还为多色同时成像提供了新的工具选择。

研究人员采用了几项关键技术方法：利用遗传密码扩展技术将非天然氨基酸3-氨基酪氨酸定点插入StayGold蛋白的Y58位点；通过X射线晶体学解析了StayRose的高分辨率结构（1.6 ?）；使用尺寸排阻色谱验证蛋白单体化效果；结合体外和体内（大肠杆菌和斑马鱼胚胎）光稳定性评估体系；采用质谱分析确认非天然氨基酸的掺入效率。

INTRODUCTION

荧光蛋白的光漂白问题严重限制了高质量显微镜图像的获取。StayGold作为一种新型二聚体绿色荧光蛋白，通过序列工程已被单体化，以其高光稳定性应对这一挑战。当前焦点是生产不同颜色的StayGold衍生物以便同时标记多个靶点。非天然氨基酸3-氨基酪氨酸先前已显示可通过遗传密码扩展掺入sfGFP发色团使其红移。本研究将相同策略应用于StayGold，通过将酪氨酸-58替换为3-氨基酪氨酸实现红移。

RESULTS

在StayGold的Y58位点尝试掺入3-氨基酪氨酸（相当于sfGFP的Y66），产生了肉眼可见的红色细菌培养物。将Y58位点带有3-氨基酪氨酸的His标签StayGold命名为StayRose并进行纯化，通过胰蛋白酶肽段质谱分析确认了3-氨基酪氨酸的掺入。StayGold在497 nm有最大激发峰，在504 nm有发射峰，而StayRose在530 nm有最大激发峰，并在588 nm发射红色荧光。不同制备条件下（1 mM或2 mM 3-氨基酪氨酸）的StayRose样品显示了可变的StayGold物种比例。

StayRose的1.6 ?晶体结构显示其整体结构与StayGold几乎相同，省略图显示氨基修饰的发色团具有明确的电子密度，氨基处于高占据率且锁定在单一构象。发色团与Y64、E211和N137残基形成氢键，但氨基自身不形成任何氢键。结构证实3-氨基酪氨酸被StayGold折叠舒适地容纳，红移仅由额外氨基引起，发色团其他部分无进一步修饰。

通过E138D突变实现了StayRose的单体化，产生mStayRose(E138D)，经尺寸排阻色谱确认为单体。单体化消除了二聚体StayRose在488 nm激发下观察到的红色荧光尾部，这可能是由于StayGold-StayRose异源二聚体中的FRET所致。

体外光稳定性实验显示StayRose和mStayRose(E138D)都具有光稳定性，在激光照射下仅观察到荧光强度的适度降低。StayRose荧光在激光照射第一分钟意外增加，可能与激光诱导的氧化和蛋白质成熟有关，或代表3-氨基酪氨酸基发色团的意外光激活特性。mCherry在前100秒快速失去亮度，强度下降80%。体内细菌光稳定性实验进一步证明了StayRose和mStayRose(E138D)的光稳定性，尽管mStayRose(E138D)的表达水平远低于StayRose和mCherry。

在mStayRose(E138D)两端添加短尾序列（n1和c4）提高了细菌表达的亮度。尝试通过K192Y突变进一步红移530 nm激发峰，但该突变似乎降低了3-氨基酪氨酸掺入效率，检测到增大的497 nm激发峰。

在斑马鱼胚胎中测试了mStayRose(E138D)的生物应用，注射重组LifeAct-mStayRose(E138D)和NLS-mStayGold(E138D)-NLS后，在活体斑马鱼胚胎中清晰可见肌动蛋白细胞骨架和核结构。mStayRose(E138D)在成像过程中强度增加，与细菌和体外观察到的趋势一致。在大肠杆菌中，mStayRose(E138D)和mCherry被插入细菌环蛋白FtsZ的环中，mStayRose(E138D)允许可视化明确的FtsZ环，而mCherry过表达则模糊了清晰环的观察。

DISCUSSION

本研究通过用3-氨基酪氨酸修饰StayGold发色团，创建了一种新型荧光蛋白StayRose，具有显著红移的激发和发射光谱。获得了StayRose的高分辨率X射线结构，证明其保留了StayGold的高光稳定性，并使用E138D突变将其单体化。随后通过添加侧翼区域改进细菌表达，并尝试定向诱变进一步红移。通过融合目的蛋白并在活细菌和注射的斑马鱼胚胎中成像，证明了该单体的适用性。

需要额外步骤使StayRose成为有效的荧光成像工具。遗传密码扩展工具的已知局限性包括多组件需求降低了易用性。tRNA合成酶不忠实性导致的低水平StayGold存在是多靶点成像研究的问题。已证明可通过增加3-氨基酪氨酸浓度调节，但可能难以完全消除。提高3-氨基酪氨酸掺入效率将使StayRose成为更强大的工具。StayRose的光激活现象值得进一步检查支撑3-氨基酪氨酸基荧光团的电子分布和成熟化学。通过减少3-氨基酪氨酸补充故意错误掺入酪氨酸，将使目的蛋白从单一构建体表达为绿色或红色形式的mStayRose(E138D)混合物，可通过检测红绿寡聚体产生的FRET评估融合靶标的单体与寡聚状态。

StayRose证明了对StayGold光稳定性至关重要的结构特征不仅限于绿色荧光，标志着开发各种颜色光稳定StayGold变体的重要一步。

结论意义

本研究成功开发出StayRose，这是第一种基于3-氨基酪氨酸修饰的高光稳定性红色荧光蛋白。通过遗传密码扩展技术、高分辨率结构解析和系统的功能表征，研究团队证明StayRose在保持StayGold优异光稳定性的同时实现了显著的红移（激发/发射峰：530/588 nm）。单体变体mStayRose(E138D)在斑马鱼胚胎和大肠杆菌中的成功应用，证明了其在实际生物研究中的实用价值。

该研究的重要意义在于：首先解决了红色荧光蛋白光稳定性不足的技术瓶颈，为长时间多色成像提供了新选择；其次首次解析了3-氨基酪氨酸基发色团的高分辨率结构，为理解这类修饰的发色团提供了结构基础；此外，研究中观察到的光激活现象为开发新型光激活荧光蛋白提供了新思路；最后，通过单构建体表达红绿混合荧光蛋白的策略，为研究蛋白质寡聚化状态提供了创新方法。

这项研究不仅推动了荧光蛋白工程技术的发展，也为细胞生物学和发育生物学研究提供了新的工具选择，特别是在需要长时间观察动态过程的实验中，StayRose及其衍生变体将发挥重要作用。未来通过优化遗传密码扩展系统和提高非天然氨基酸掺入效率，这类荧光蛋白有望成为多色成像工具箱中的重要组成部分。