耐盐芽孢杆菌Cal.l.30和贝莱斯芽孢杆菌Cal.r.29通过双重作用机制调控黄瓜白粉病菌效应蛋白RPS27A并诱导系统抗性

《Physics of Life Reviews》：Biocontrol potential of Bacillus halotolerans Cal.l.30 and Bacillus velezensis Cal.r.29 against cucumber powdery mildew

本研究针对黄瓜白粉病（PM）防治难题，探讨了从金盏花分离的内生芽孢杆菌Cal.l.30（Bacillus halotolerans）和Cal.r.29（Bacillus velezensis）的生物防治潜力。温室试验显示，三次叶面喷施后，Cal.l.30和Cal.r.29分别使病害严重度降低98%和54。研究通过显微观察、RT-qPCR和分子对接分析，揭示了菌株通过延迟分生孢子萌发、调控宿主防御基因（PR4、MASS1、WRKY51）表达和靶向病原菌效应蛋白RPS27A的双重作用机制，为开发绿色防控剂提供了新策略。

　　

黄瓜是全球广泛种植的重要蔬菜作物，但在温室和露地栽培中常受到白粉病的严重威胁。这种病害主要由专性活体营养病原菌Podosphaera xanthii引起，其依赖活体寄主组织完成生活史，给防治带来极大挑战。目前，化学杀菌剂仍是控制白粉病的主要手段，但长期频繁使用导致病原菌对包括甾醇脱甲基抑制剂（DMIs）、醌外抑制剂（QoIs）和琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHIs）在内的多种主要杀菌剂类别产生抗药性，防治效果下降。同时，杀菌剂残留对食品安全和环境的负面影响也引发广泛关注。因此，开发可持续、环境友好的替代防治策略成为迫切需求。其中，利用有益微生物进行生物防治作为一种有前景的绿色防控方法，在病害综合管理体系中日益受到重视。

芽孢杆菌属（Bacillus）物种，特别是内生菌株，因其能够定殖植物组织、促进植物生长，并通过产生抗菌化合物、营养和生态位竞争以及诱导系统抗性（ISR）等方式拮抗多种植物病原菌而备受关注。近年来，Bacillus halotolerans和Bacillus velezensis这两个物种因其产生具有抗菌和免疫调节活性的次级代谢产物而显示出显著的生物防治潜力。

在这项发表于《Physics of Life Reviews》的研究中，希腊贝纳基植物病理研究所的研究团队从药用植物金盏花（Calendula officinalis）中分离出两株内生芽孢杆菌：Cal.l.30（Bacillus halotolerans）和Cal.r.29（Bacillus velezensis），并系统评估了它们对黄瓜白粉病的防治效果及其作用机制。

研究人员运用了多种关键技术方法：通过形态学观察和分子鉴定（特异性引物PCR）确认病原菌为Podosphaera xanthii；利用体外叶片生物测定法评估细菌悬浮液对分生孢子萌发和菌丝生长的抑制效果；在温室条件下进行病害防治试验，计算病情进展曲线下面积（AUDPC）；采用RT-qPCR技术分析黄瓜防御相关基因（PR1、PR4、MASS1、WRKY51）和病原菌效应蛋白基因（RPS27A）的表达变化；最后通过分子对接分析（CB-DOCK2服务器）研究细菌代谢产物与病原菌效应蛋白的相互作用。

研究结果首先证实了病原菌的身份。通过显微镜观察，发现分生孢子尺寸为27-41×14-27μm，长宽比平均为1.7μm，95%的未萌发分生孢子中存在纤维小体，这些特征与Podosphaera xanthii相符。分子鉴定使用特异性引物S1/S2和G1/G2进行PCR扩增，结果显示只有S1/S2引物对产生了454bp的特异性条带，进一步证实病原菌为P. xanthii而非Golovinomyces cichoracearum。

在体内生物测定中，研究人员发现Cal.l.30和Cal.r.29均能显著抑制P. xanthii分生孢子的萌发，但Cal.l.30表现出更强的抑制效果。Cal.l.30的粗提物和细胞上清液分别使萌发率降低84%和82%，而Cal.r.29的粗提物仅降低54%。病害严重度评估显示，Cal.l.30处理使病害严重度降低85%-82%，而Cal.r.29的效果相对较弱。显微镜观察还发现，Cal.l.30细胞在叶片表面分布更均匀，更接近分生孢子，这可能是其更高效的原因之一。

研究人员进一步将分生孢子萌发过程分为4个阶段：仅形成萌发管、形成初级菌丝、形成第二菌丝和形成第三菌丝。发现Cal.l.30粗提物或细胞上清液处理的所有萌发分生孢子（100%）都停留在萌发管阶段，而其他处理则显示出不同发育阶段的分布，表明Cal.l.30能更有效地抑制病原菌的发育。

温室试验结果更加令人印象深刻。叶面喷施Cal.l.30或Cal.r.29后人工接种P. xanthii，发现两种处理都能成功抑制病原菌在黄瓜叶片上的生长。接种14天后，Cal.r.29处理组的病害严重度为17%，而Cal.l.30处理组仅为0.8%，对照组则为37%。病情进展曲线下面积（AUDPC）分析显示，Cal.r.29处理组的AUDPC值比对照组低62%，而Cal.l.30处理组实现了98%的降低，表现出极佳的防治效果。

为了探究其作用机制，研究人员分析了黄瓜防御相关基因的表达模式。发现Cal.l.30处理显著上调了PR4、MASS1和WRKY51基因的表达，其中MASS1表达上调超过4倍，而PR1表达未受影响。相反，Cal.r.29处理导致大多数测试基因的下调（除PR4外无显著变化）。这些结果表明两种菌株可能通过不同的机制诱导植物抗性：Cal.l.30可能通过激活茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信号通路相关的防御机制，而Cal.r.29的作用机制则有所不同。

特别有趣的是，研究人员发现P. xanthii的效应蛋白基因RPS27A在两种芽孢杆菌处理下都表现出极显著的下调。RPS27A是最近鉴定的P. xanthii效应蛋白，在病原菌毒力中起关键作用。这一发现表明芽孢杆菌可能通过调控病原菌效应蛋白的表达来抑制其致病性。

分子对接分析揭示了Cal.l.30代谢产物与RPS27A效应蛋白之间的强结合亲和力。在分析的代谢物中，bacillibactin和mojavensin A与RPS27A的结合能分别为-8和-6.2 kcal/mol，表现出最强的结合能力。这表明这些代谢物可能直接与病原菌效应蛋白相互作用，干扰其功能，从而抑制病原菌毒力。

研究结论表明，Bacillus halotolerans Cal.l.30和Bacillus velezensis Cal.r.29都对黄瓜白粉病有防治效果，但Cal.l.30表现出更优异的综合性能。Cal.l.30通过双重作用机制实现对P. xanthii的有效控制：一方面通过产生多种抗菌代谢产物（如mojavensin A、bacillibactin等）直接抑制病原菌生长和发育；另一方面通过诱导宿主防御反应，特别是激活JA和ET信号通路相关的ISR机制。分子对接结果还提示，Cal.l.30的代谢产物可能直接靶向病原菌的关键效应蛋白RPS27A，从而干扰其致病性。

这项研究的重要意义在于首次系统评估了从金盏花中分离的两种内生芽孢杆菌对黄瓜白粉病的防治效果，并深入揭示了其作用机制。研究发现Cal.l.30不仅能直接抑制病原菌，还能激活植物的系统抗性，这种双重作用机制为其作为生物防治剂的应用提供了坚实理论基础。特别是发现细菌代谢产物可能与病原菌效应蛋白直接相互作用的现象，为开发新型靶向杀菌剂提供了新思路。研究结果为开发高效、可持续的黄瓜白粉病防控策略提供了重要科学依据，对减少化学杀菌剂使用、促进农业可持续发展具有重要实践价值。