骨髓纤维化中的促血栓形成特征：纤维蛋白原氧化及鲁索替尼的改善作用

《Thrombosis Research》：Prothrombotic profiles in myelofibrosis: Fibrinogen oxidation and the beneficial effects of ruxolitinib

本研究针对骨髓纤维化(MF)患者血栓风险高但机制不清的临床问题，聚焦氧化应激对纤维蛋白原的结构与功能影响及鲁索替尼的干预效果。研究发现MF患者存在显著氧化还原失衡，导致纤维蛋白原氧化、结构改变、聚合功能受损及纤溶抵抗，而鲁索替尼治疗可改善氧化应激并恢复纤维蛋白原功能。该研究首次揭示了氧化修饰纤维蛋白原驱动MF促血栓表型的新机制，为血栓风险评估和靶向治疗提供了新见解。

　　

骨髓纤维化（Myelofibrosis, MF）是一种罕见的BCR-ABL阴性骨髓增殖性肿瘤（MPN），以干细胞来源的克隆性骨髓增殖、骨髓纤维化、髓外造血和异常炎症为特征。该病预后极差，诊断后中位生存期仅为2至6年。除了贫血、脾肿大、乏力、盗汗等典型症状，血栓形成是MF患者发病和死亡的主要原因之一，高达75%的MPN患者会经历主要不良心血管事件。然而，MF患者血栓风险往往被低估，其潜在的分子机制也尚未完全阐明。

已知约90%的MF患者携带JAK2、CALR或MPL基因的驱动突变，其中JAK2突变尤其会促进细胞因子非依赖性生长、STAT蛋白激活并增强活性氧（ROS）产生。慢性炎症和氧化应激被认为是血栓风险的关键驱动因素。纤维蛋白原（Fibrinogen）作为凝血和炎症过程中的关键因子，因其对氧化修饰的高度敏感性，可能在这一过程中扮演核心角色。有研究表明，MPN患者存在内皮细胞功能障碍、ROS和促炎细胞因子产生增加，并伴有纤溶受损。但氧化应激是否通过直接修饰纤维蛋白原，从而导致其功能改变并促进MF的血栓形成，此前缺乏直接证据。

为了解决这一科学问题，由Francesca Nencini、Matteo Becatti等研究人员组成的研究团队开展了一项研究，旨在探讨MF患者中氧化应激诱导的纤维蛋白原结构和功能变化，并评估一线JAK抑制剂鲁索替尼（Ruxolitinib）的潜在改善作用。该研究结果发表在《Thrombosis Research》期刊上。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术：他们首先招募了15名未经治疗的MF患者、39名鲁索替尼治疗的MF患者以及40名匹配的健康对照者，采集血浆样本。随后，通过乙醇沉淀法纯化纤维蛋白原，并系统评估了血浆氧化还原状态指标（包括脂质过氧化产物MDA、硝酸盐/亚硝酸盐水平、总抗氧化能力ORAC和游离硫醇含量）。对纯化的纤维蛋白原，他们利用圆二色谱（CD）分析二级结构，通过双酪氨酸含量和固有荧光（IF）光谱评估氧化程度和三级结构变化。功能分析方面，通过凝血酶催化的纤维蛋白聚合动力学实验评估凝血功能，并通过纤溶酶介导的纤维蛋白降解实验评估纤溶功能。此外，还采用共聚焦显微镜观察了纤维蛋白网络的结构特征，并通过体外实验（使用自由基引发剂AAPH处理纤维蛋白原）验证了氧化应激的直接作用。

3.1. 临床和人口学特征

研究人群的临床特征显示，各组在年龄、性别、MF类型、IPSS评分、纤维化分级、驱动突变等方面基本匹配。

3.2. MF患者和对照者的血浆氧化应激标志物

与健康对照组相比，MF患者血浆中脂质过氧化水平（MDA）和硝酸盐/亚硝酸盐水平显著升高，而总抗氧化能力（ORAC）和游离硫醇含量显著降低，表明MF患者存在全身性的氧化还原失衡。

3.3. 纤维蛋白原结构改变

对纯化纤维蛋白原的结构分析显示，MF患者的纤维蛋白原其圆二色谱在215-225 nm区域的负峰减弱，表明α-螺旋含量减少。同时，MF患者纤维蛋白原的双酪氨酸含量显著增加，固有荧光强度显著降低，这些结果共同证实了MF患者纤维蛋白原存在显著的氧化修饰和结构改变。

3.4. 纤维蛋白原功能分析

功能实验结果表明，MF患者的纤维蛋白原其凝血酶催化的纤维蛋白聚合能力受损，表现为滞后时间（Lag phase）延长、最大聚合速率（Vmax）和最大吸光度（Max Abs）降低。更重要的是，MF患者形成的纤维蛋白对纤溶酶介导的降解抵抗性增强，经过6小时纤溶酶消化后，纤维蛋白β链的残留量显著高于对照组。

3.5. 氧化还原状态与纤维蛋白原改变之间的相关性

相关性分析显示，纤维蛋白原的氧化标志物（双酪氨酸含量）与纤维蛋白聚合参数（如Max Abs呈负相关，与Lag phase呈正相关）以及纤溶抵抗性呈显著正相关。血浆氧化应激标志物也与纤维蛋白原的功能参数密切相关，表明氧化应激是驱动纤维蛋白原功能异常的关键因素。

3.6. 鲁索替尼治疗后氧化还原状态及纤维蛋白原结构和功能参数的变化

对接受鲁索替尼治疗的MF患者进行分析发现，治疗后患者血浆硝酸盐/亚硝酸盐水平显著下降，游离硫醇含量增加，提示氧化应激得到缓解。相应地，纤维蛋白原的双酪氨酸含量下降，固有荧光强度增强，表明其氧化损伤减轻、结构有所恢复。功能上，纤维蛋白聚合参数改善，纤维蛋白对纤溶酶的敏感性也提高。

3.7. 纤维蛋白结构：共聚焦显微镜分析

共聚焦显微镜图像直观地展示了结构差异：健康对照的纤维蛋白网络纤维粗大、孔隙大、结构疏松；而MF患者的纤维蛋白网络则纤维纤细、排列致密、孔隙狭小。鲁索替尼治疗后，纤维蛋白网络的结构趋向于正常对照，变得更为疏松多孔。这从形态学上解释了为何MF患者的纤维蛋白 clot 更稳定、更难被降解。

3.8. 氧化应激诱导血栓形成的体外研究

体外使用AAPH诱导纤维蛋白原氧化，成功模拟了在MF患者中观察到的现象：氧化后的纤维蛋白原表现出聚合延迟、形成的纤维蛋白对纤溶酶降解的抵抗性增强。而抗氧化剂Trolox的加入可以阻止这些变化，证实了氧化应激的直接因果作用。

该研究的讨论部分对上述发现进行了深入阐释。研究人员指出，他们的工作首次从MF患者体内纯化出纤维蛋白原，并对其进行了全面的结构和功能表征。结果清晰地表明，MF患者体内的氧化应激环境导致了纤维蛋白原的氧化修饰，进而引起其结构和功能异常，包括聚合动力学改变和纤溶抵抗性增强。这种功能异常的纤维蛋白原形成了更致密、更稳定的纤维蛋白网络，从而构成了MF患者高血栓风险的重要分子基础。

值得注意的是，尽管MF患者的纤维蛋白聚合速度减慢，但这并非抗血栓的特征。体外氧化实验表明，氧化修饰延长了聚合的滞后时间，但同时显著增强了纤维蛋白对降解的抵抗性。这意味着氧化改变的是凝血酶与纤维蛋白原之间的相互作用，最终形成的纤维蛋白 clot 在结构上更倾向于促血栓形成。

本研究的一个重要发现是鲁索替尼的治疗作用。鲁索替尼作为JAK抑制剂，可通过抑制JAK-STAT通路和减少炎症细胞因子释放，间接改善MF患者的氧化应激状态。本研究证实，鲁索替尼治疗能够部分逆转纤维蛋白原的氧化损伤，恢复其正常结构和功能，这提示鲁索替尼可能对MF患者具有心血管保护作用，超越了其缓解症状和缩小脾脏的传统认知。

当然，本研究也存在一些局限性，例如样本量较小，未能根据临床特征进行亚组分析，以及专注于纯化蛋白而未能完全模拟体内血浆环境的复杂性。未来的研究需要在更大队列中验证这些发现，并利用血浆基础实验进一步探索。

综上所述，这项研究揭示了氧化修饰纤维蛋白原是驱动骨髓纤维化患者促血栓表型的一个此前未被重视的关键机制。这不仅为理解MF血栓并发症的病理生理学提供了新的视角，也为临床实践中评估血栓风险（如监测血浆氧化还原标志物和纤维蛋白原功能）和探索新的治疗策略（如抗氧化辅助治疗）提供了潜在靶点。研究结果强调了在MF的诊疗中，关注氧化应激和纤维蛋白原质量的重要性，对于改善患者预后具有重要意义。