肠道菌群丁酸通过RUNX3调控Nr4a1highZFP36high定居巨噬细胞分化并经由NR4A1/ERK1/2 MAPK通路维持肠道稳态的机制研究

《Gut Microbes》：Gut microbiota butyrate mediated RUNX3 promotes Nr4a1highZFP36highresident macrophages via NR4A1/ERK1/2 MAPK to maintain gut homeostasis

本研究揭示了肠道菌群代谢产物丁酸通过长链非编码RNA lncLy6c介导的组蛋白H3K4me3修饰上调转录因子RUNX3表达，进而驱动Nr4a1highZFP36high表型肠道定居巨噬细胞分化的新机制。该过程依赖于NR4A1调控的ERK1/2 MAPK信号通路激活，最终通过ZFP36介导的炎症因子mRNA降解维持肠道免疫稳态，为炎症性肠病（IBD）的治疗提供了新的靶点思路。

　　

肠道菌群丁酸介导的RUNX3通过NR4A1/ERK1/2 MAPK通路促进Nr4a1^highZFP36^high定居巨噬细胞分化以维持肠道稳态

引言

肠道稳态对于全身健康至关重要，其失衡与多种疾病相关，包括代谢紊乱、炎症性肠病（IBD）和结直肠癌等。肠道黏膜定居着人体内最大数量的巨噬细胞群体，这些细胞在维持肠道稳态中扮演着关键角色。然而，调控这些定居巨噬细胞分化和功能的精确机制尚未完全阐明。肠道菌群及其代谢产物对巨噬细胞分化具有重要影响。本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）发现，肠道菌群衍生的丁酸可通过RUNX3诱导Nr4a1^highZFP36^high定居巨噬细胞的分化，从而维持肠道稳态。

丁酸介导的LncLy6c诱导的肠道定居巨噬细胞高表达RUNX3

长链非编码RNA lncLy6c受丁酸直接调控，并能促进外周血Ly6C^high炎症性巨噬细胞向Ly6C^int/neg免疫抑制性巨噬细胞分化。研究发现，与野生型（WT）小鼠相比，lncLy6c基因敲除（KO）小鼠结肠组织中定居巨噬细胞（CD45⁺CD11b⁺CD64⁺CD103^–MHCII⁺Ly6C^–/low）的比例显著降低。scRNA-seq分析进一步证实，lncLy6c KO小鼠的定居巨噬细胞群（Macro 3）比例明显减少，而这些细胞低表达CCR2、F10和Ly6C，高表达免疫抑制标志物如Mrc1（CD206）和CX3CR1。对scRNA-seq数据的分析发现，lncLy6c KO小鼠的定居巨噬细胞中多个基因表达下调，其中包括关键转录因子RUNX3。这一发现在转录水平和蛋白水平均得到qRT-PCR、Western blotting和免疫染色验证。结果表明，丁酸诱导的lncLy6c能够促进具有高RUNX3表达的肠道定居巨噬细胞的分化。

RUNX3^{fl/fl-Lyz2-Cre}小鼠结肠组织中肠道定居巨噬细胞减少

RUNX3在维持肠道稳态中具有潜在作用。利用RUNX3 shRNA慢病毒的巨噬细胞移植模型，发现RUNX3敲低显著减少了定居巨噬细胞的数量，表明其在促进炎症单核细胞向定居巨噬细胞分化中必不可少。为了进一步研究RUNX3的调控功能，研究人员构建了巨噬细胞特异性RUNX3基因敲除小鼠（RUNX3^{fl/fl-Lyz2-Cre}），并与RUNX3^fl/fl对照小鼠进行比较。对结肠巨噬细胞的scRNA-seq分析揭示了五个不同的亚群。值得注意的是，表征为低表达CCR2和F10的定居巨噬细胞簇（Macro-3）在RUNX3^{fl/fl-Lyz2-Cre}小鼠中显著减少，而CCR2^high F10^high炎症性巨噬细胞群（Macro-5和Macro-1）则保持不变。流式细胞术分析证实了这些发现，显示RUNX3^{fl/fl-Lyz2-Cre}小鼠外周血中免疫抑制性的CD11b⁺CD115⁺Ly6C^neg巨噬细胞以及结肠组织中的CD45⁺CD11b⁺CD64⁺MHCII⁺Ly6C^low/–定居巨噬细胞均减少。伪时间分析证实簇3（Macro-3）代表肠道定居巨噬细胞，而簇5和1（Macro-5和Macro-1）来源于炎症性血液单核细胞/巨噬细胞。这些定居巨噬细胞的耗竭伴随着结肠组织中Th1/Th17反应升高和Treg细胞群减少。这些结果共同表明，RUNX3缺陷导致肠道定居巨噬细胞减少，并伴随结肠组织中炎症细胞增加。

RUNX3^{fl/fl-Lyz2-Cre}小鼠对DSS诱导的结肠炎高度敏感

为了进一步研究RUNX3在肠道定居巨噬细胞中的作用，研究人员使用了DSS诱导的结肠炎模型。与对照RUNX3^fl/fl小鼠相比，RUNX3^{fl/fl-Lyz2-Cre}小鼠对化学诱导的结肠炎表现出更高的易感性，表现为体重减轻加剧、存活率降低、出血和腹泻更严重（疾病指数更高）、结肠长度缩短以及组织学评分升高。此外，RUNX3^{fl/fl-Lyz2-Cre}小鼠的结肠组织中定居巨噬细胞显著减少。值得注意的是，RUNX3^{fl/fl-Lyz-Cre}小鼠结肠组织中促炎细胞因子（TNFα、IL-1β和IL-6）水平升高，而抗炎细胞因子（IL-10和TGFβ）水平降低。对这些T细胞亚群的进一步评估观察到RUNX3^{fl/fl-Lyz2-Cre}小鼠中Th1和Th17细胞增加，但Treg细胞减少。这些发现证明，RUNX3介导的肠道定居巨噬细胞调控对于维持肠道稳态至关重要。

RUNX3介导的巨噬细胞分化依赖于Nr4A1介导的ERK1/2/MAPK通路

为了确定介导RUNX3依赖性巨噬细胞分化的关键因子，研究人员聚焦于Nr4a1，这是一个已知的定居巨噬细胞发育调控因子。scRNA-seq显示，与对照组相比，RUNX3^{fl/fl-Lyz2-Cre}小鼠结肠巨噬细胞中Nr4a1表达显著降低。有趣的是，这种下调在Macro-3亚群（定居巨噬细胞）中最为显著，而其他巨噬细胞群（Macro-1, -4, 和 -5）仅显示轻微降低。qRT-PCR和Western blot也证实了分离的RUNX3缺陷定居巨噬细胞中Nr4a1水平较低。在Nr4a1 shRNA慢病毒感染的巨噬细胞移植模型中，观察到外周血中免疫抑制性的CD11b⁺CD115⁺Ly6C^neg定居巨噬细胞以及结肠组织中CD45⁺CD11b⁺CD64⁺MHCII⁺Ly6C^low/–定居巨噬细胞显著减少。相反，接受Nr4a1慢病毒感染巨噬细胞的小鼠不仅外周血CD11b⁺CD115⁺Ly6C^neg定居巨噬细胞显著增加，结肠组织中CD45⁺CD11b⁺CD64⁺MHCII⁺Ly6C^low/–定居巨噬细胞水平也升高。这些发现进一步支持了Nr4a1在促进肠道定居巨噬细胞分化中的关键作用。

为了进一步阐明Nr4a1诱导定居巨噬细胞分化的机制，研究人员进行了KEGG和GSEA分析。这些分析揭示了定居巨噬细胞（Macro-3）与其他巨噬细胞亚群相比，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路显著富集。值得注意的是，这种MAPK通路特征也在图1中鉴定的定居巨噬细胞群（Macro-3）中观察到，表明MAPK信号与定居巨噬细胞特性之间存在一致关联。这些发现表明Nr4a1可能通过独特的MAPK依赖性机制促进定居巨噬细胞分化。对LncLy6c KO和RUNX3^{fl/fl-Lyz2-iCre}小鼠scRNA-seq数据的比较分析显示，定居巨噬细胞中的MAPK信号通路不仅涉及Nr4a1，还涉及关键调控因子如Atf4、Daxx、Jund、Pak1、Flna和Hspa1a。系统性评估这些基因对定居巨噬细胞分化的影响发现，每个基因都显著影响分化过程。值得注意的是，MAPK通路包含四个主要亚家族：细胞外信号调节激酶（ERK1/2）、c-Jun N末端激酶（JNK1/2/3）、p38-MAPK和ERK5。靶向基因沉默实验显示，敲低任何这些基因都会显著减弱ERK1/2 MAPK的激活，而不影响ERK5和JNK通路。只有Nr4A1、Jund和Flna影响p38的激活，表明p38-MAPK通路不参与RUNX3介导的巨噬细胞分化。这种选择性损伤强烈提示ERK1/2/MAPK通路是RUNX3依赖性定居巨噬细胞分化的主要介质。与此机制一致，体内药理学抑制ERK1/2/MAPK信号能有效抑制定居巨噬细胞分化。这些结果共同表明，RUNX3通过Nr4a1依赖的ERK1/2/MAPK信号轴促进定居巨噬细胞的发育。

RUNX3通过Nr4A1/ERK1/2/MAPK通路促进ZFP36表达

巨噬细胞主要通过细胞因子和趋化因子的分泌介导其生物学功能。ZFP36（锌指蛋白36）能促进含有AU富集元件（AREs）的细胞因子和趋化因子mRNA的降解。研究发现，与RUNX3^fl/fl对照相比，RUNX3 KO结肠定居巨噬细胞中ZFP36水平显著降低。scRNA-seq分析进一步证明，RUNX3 KO小鼠定居巨噬细胞（Macro 3簇）中ZFP36表达明显降低。qRT-PCR和免疫印迹分析证实了RUNX3^{fl/fl-Lyz2-Cre}小鼠结肠定居巨噬细胞中ZFP36的下调。scRNA-seq分析显示，与对照组相比，RUNX3 KO小鼠定居巨噬细胞（Macro 3）中IL-1β和CCL5表达下降更明显。qRT-PCR分析证实了关键细胞因子和趋化因子的减少，包括IL-1β和CCL5。值得注意的是，接受ZFP36 shRNA慢病毒感染巨噬细胞移植的小鼠与对照组相比，对化学诱导的结肠炎表现出更高的易感性，表现为体重减轻更明显、存活率降低、出血和腹泻严重程度增加以及总体疾病活动指数更高。相反，移植过表达ZFP36的巨噬细胞能显著保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎。这些发现强调了ZFP36在定居巨噬细胞中维持肠道稳态的关键作用。

已知ZFP36的表达受ERK信号通路调控。鉴于Nr4a1/ERK1/2 MAPK信号参与RUNX3介导的定居巨噬细胞调控，研究人员进一步研究了其在调节这些细胞中ZFP36表达的作用。沉默Nr4a1或ERK1/2不仅下调了ZFP36表达，还增强了促炎细胞因子的产生，包括IL-1β和CCL5。相反，Nr4a1或ERK1/2过表达上调了ZFP36，同时抑制了IL-1β和CCL5的表达。同样，抑制ERK1/2信号也降低了ZFP36水平并增加了IL-1β和CCL5的表达。此外，研究人员检查了定居巨噬细胞衍生的趋化因子与淋巴细胞之间的相互作用，观察到趋化因子-淋巴细胞相互作用增强。这些相互作用可能有助于RUNX3^{fl/fl-Lyz2-Cre}小鼠结肠组织中Th1和Th17细胞频率升高以及Treg细胞群减少。这些发现共同证明，RUNX3通过Nr4a1相关的ERK1/2/MAPK通路增强结肠巨噬细胞中ZFP36的表达，并减弱促炎细胞因子和趋化因子的产生。

丁酸通过lncLy6c介导的H3K4me3修饰促进RUNX3表达

先前研究表明，肠道菌群代谢物丁酸通过lncLy6c促进Ly6C^low免疫抑制性巨噬细胞的分化。本研究进一步证实，丁酸能增强野生型（wt）小鼠结肠组织中Ly6C^low肠道定居巨噬细胞的分化，但在lncLy6c缺陷小鼠中无此效果。鉴于丁酸介导的lncLy6c调控RUNX3表达，研究人员假设丁酸也可能调节RUNX3水平。与此一致，RNA测序显示，在丁酸处理后，wt小鼠的巨噬细胞中RUNX3表达升高，而lncLy6c缺陷小鼠的巨噬细胞中则无此现象。这些发现得到了qRT-PCR和免疫印迹分析的证实。先前研究表明，丁酸介导的lncLy6c可与多种H3K4me3相关蛋白相互作用以增强基因表达。基因组浏览器分析进一步证明了RUNX3启动子区域存在H3K4me3富集。染色质免疫沉淀（ChIP）-PCR实验确实显示，lncLy6c缺陷的巨噬细胞在RUNX3启动子区域的H3K4me3富集减少。相反，丁酸处理增加了该区域的H3K4me3标记。此外，敲低H3K4me3相关蛋白——包括WDR5（WD重复结构域蛋白5）、RBBP5（视网膜母细胞瘤结合蛋白5）、MLL（混合谱系白血病）、DPY30和ASH2L（缺失-小-同源异形-2-样蛋白）——显著影响了RUNX3表达。这些结果表明丁酸介导的lncLy6c通过H3K4me3修饰上调RUNX3表达。鉴于RUNX3与定居巨噬细胞中Nr4a1和ZFP36表达的既定关系，研究人员也检测了这些因子。沉默WDR5、ASH2L、MLL、RBBP5或DPY30同样改变了丁酸暴露后Nr4a1和ZFP36的表达。这些发现共同表明，丁酸通过lncLy6c介导的H3K4me3修饰诱导RUNX3表达。

丁酸通过RUNX3促进肠道定居巨噬细胞的分化

研究人员最后研究了丁酸对结肠定居巨噬细胞分化的影响。给小鼠施用丁酸钠（NaB）后，观察到丁酸能有效促进RUNX3^fl/fl小鼠结肠定居巨噬细胞的分化，但在RUNX3^{fl/fl-Lyz2-Cre}小鼠中无此效果。值得注意的是，健康个体的粪便和血清中短链脂肪酸（SCFAs）水平通常高于炎症性肠病（IBD）患者，如溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）。鉴于SCFA丁酸可诱导RUNX3表达，这些发现提示健康个体中较高的SCFA水平也可能有助于肠道定居巨噬细胞中RUNX3、Nr4a1和ZFP36的表达。与此一致，体外实验证实丁酸上调了人巨噬细胞中RUNX3、Nr4a1和ZFP36的表达。研究人员进一步检测了健康个体结肠定居巨噬细胞中RUNX3、Nr4a1和ZFP36的表达。根据Garrido-Trigo等人的发现，UC和CD患者的巨噬细胞可分为五个亚集：M0、M2（定居）巨噬细胞、两个转录不同的M1群体（M1 ACOD1和M1 CXCL5）以及炎症依赖性替代（IDA）巨噬细胞。然而，健康个体仅表现出两个亚集：M0和定居（M2）巨噬细胞。值得注意的是，健康个体的定居巨噬细胞（M2）显示出显著更高的Nr4a1、ZFP36和RUNX3表达水平。有趣的是，在IBD患者的结肠组织中，RUNX3、Nr4a1和ZFP36不仅在定居巨噬细胞中高表达，在炎症性巨噬细胞中也高表达，表明巨噬细胞中它们的表达也可能受到炎症微环境的影响。因此，健康个体的结肠定居巨噬细胞中存在RUNX3、Nr4a1和ZFP36的高表达。

讨论

本研究证明，肠道菌群衍生的丁酸通过激活RUNX3，增强Nr4a1^highZFP36^high巨噬细胞的分化，从而促进肠道稳态。研究结果揭示，肠道定居巨噬细胞中Nr4A1的上调介导了ERK1/2/MAPK通路，该通路在RUNX3依赖性巨噬细胞分化和ZFP36表达中起关键作用。肠道菌群代谢物丁酸可通过LncRNA lncLy6c介导的H3K4me3修饰诱导结肠定居巨噬细胞中RUNX3的表达。与此机制一致，健康个体的粪便和血清丁酸水平显著高于IBD患者。相应地，健康供体的结肠定居巨噬细胞显示RUNX3、Nr4a1和ZFP36表达升高。总之，本研究确立了一条丁酸-RUNX3-Nr4A1/ERK1/2 MAPK-ZFP36轴，该轴驱动特化的定居巨噬细胞分化以维持肠道稳态。

研究发现表明，RUNX3介导了Nr4a1^highZFP36^high定居巨噬细胞的生成，其中ZFP36在维持肠道稳态中起关键作用。RUNX3在肠道健康中的重要性已得到充分证实。RUNX3缺陷与IBD的发生有关。RUNX3基因座的遗传变异一直与CD和UC相关，RUNX3表达降低已被证明会促进UC相关的肿瘤发生。全基因组关联研究（GWAS）进一步确定了与乳糜泻和UC相关的RUNX3基因座变异，而额外的GWAS数据揭示了RUNX3易感基因座与各种炎症性疾病之间的关联。ZFP36可作为炎症反应的关键调节因子。这种RNA结合蛋白能促进多种细胞因子和趋化因子mRNA的降解。ZFP36缺陷的基因敲除小鼠会导致促炎细胞因子积累，并引发严重的全身性炎症综合征，强调了其在炎症控制中的重要作用。

研究还证明，RUNX3介导的Nr4a1^highZFP36^high定居巨噬细胞的诱导依赖于ERK1/2 MAPK通路。先前研究已确定Nr4a1在巡逻单核细胞中高表达，并对其生存至关重要。重要的是，Nr4a1在肠道炎症单核细胞向定居巨噬细胞的分化中起关键作用，Nr4a1^?/?小鼠无法发育出足够的巨噬细胞群体。ERK1/2通路已知对巨噬细胞分化和功能至关重要，在转录和转录后水平调节细胞因子产生。值得注意的是，抑制ERK磷酸化已被证明可阻断M2巨噬细胞重编程。此外，ERK1/2磷酸化下游激酶如MSKs，这些激酶也有助于M2巨噬细胞分化。有趣的是，虽然MAPK通路与炎症性巨噬细胞功能有关，但本研究结果表明不同的MAPK信号级联可能 underlie 这些差异效应。

肠道菌群衍生的代谢物丁酸已被证明能上调RUNX3表达，从而增强结肠定居巨噬细胞的分化。越来越多的证据表明，丁酸通过多种机制对巨噬细胞产生免疫调节作用。值得注意的是，丁酸可以抑制LPS诱导的巨噬细胞促炎介质的产生。此外，丁酸钠（NaB）通过乙酰化依赖性途径，包括STAT1和NF-κB亚基p65乙酰化，促进巨噬细胞向M2表型极化。这种M2极化效应具有治疗意义，因为过继转移丁酸诱导的M2巨噬细胞已被证明有助于葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠损伤后黏液层的恢复。有趣的是，相反的报道表明丁酸也可能作为菌群衍生的危险信号，能够通过人类巨噬细胞炎症反应的表现遗传调控来调节NLRP3炎症小体激活。