Poly(U)聚合酶活性通过调控RNA稳定性促进秀丽隐杆线虫胚胎原始生殖细胞建立并限制体细胞PGL颗粒

《Developmental Biology》：Poly(U) polymerase activity promotes establishment of primordial germ cells and limits somatic PGL granules in the Caenorhabditis elegans embryo

本研究针对温度胁迫下秀丽隐杆线虫生殖系发育异常的问题，系统探究了PUP-1/PUP-2介导的RNA尿苷化修饰在胚胎发育中的调控机制。通过高通量转录组测序和活体成像技术，发现PUP-1通过促进生殖系祖细胞P4分裂和维持P颗粒稳定性来保障原始生殖细胞形成，同时通过调控RNA稳定性限制体细胞PGL-1颗粒积累。该研究揭示了poly(U)聚合酶在胚胎发育中的新功能，为理解RNA修饰与生殖细胞命运决定提供了重要线索。

　　

在生命发育的早期阶段，生殖细胞谱系的正确建立对物种延续至关重要。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为模式生物，其生殖系发育机制研究为理解后生动物发育生物学提供了重要窗口。研究表明，温度胁迫会严重影响线虫生殖系发育，但其中的分子机制尚未完全阐明。

终端尿苷酰转移酶（terminal uridylyl transferases）/poly(U)聚合酶（poly(U) polymerases, PUPs）是一类在真核生物中保守的RNA修饰酶，能够催化RNA3'末端非模板依赖的尿苷（uridine）添加，这种修饰被称为尿苷化（uridylation）。在哺乳动物和爪蟾中，尿苷化修饰参与母源mRNA的清除过程，而在秀丽隐杆线虫中，PUP-1和部分功能冗余的PUP-2在温度胁迫下对幼虫/成虫生殖系发育和胚胎存活具有保障作用。前期研究发现，pup-1(0)单突变和pup-1/-2(0)双突变体会出现生殖系身份丧失、P颗粒结构紊乱、染色质调控异常以及胚胎致死等严重表型，但PUP蛋白在早期胚胎发育中的具体功能尚不明确。

为深入探究PUP蛋白在胚胎发育中的作用机制，来自雪城大学（Syracuse University）生物学系的Leanne H. Kelley等研究人员在《Developmental Biology》上发表了最新研究成果。研究团队采用高通量RNA测序技术分析了缺失PUP-1、PUP-2或双缺失的成虫和早期胚胎转录组，结合活体胚胎成像、免疫荧光标记和实时荧光定量PCR等多种技术手段，系统阐述了PUP蛋白通过调控RNA稳定性影响原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）建立和体细胞PGL颗粒积累的新机制。

关键技术方法包括：通过培育pup-1(tm1021)、pup-2(tm4344)和pup-1/-2(om129)突变体线虫，在22°C条件下收集成虫和早期胚胎样本；使用Illumina NextSeq550平台进行RNA测序，通过HISAT2将reads比对至WS272基因组，利用edgeR进行差异丰度分析；利用内源性标记的glh-1::gfp和pgl-1::gfp株系进行活体胚胎成像，追踪P颗粒动态；通过免疫共标记PGL-1、XND-1和LSL-1蛋白评估生殖系祖细胞特征；采用实时荧光定量PCR验证转录组数据可靠性。

3.1. PUP-1和PUP-2缺失改变成虫和胚胎转录组

研究人员发现，pup-1/-2(0)双突变成虫中有2,710个mRNA特异性下调，表明这些转录本的正常表达需要PUP-1和PUP-2的共同作用。值得注意的是，pup-2(0)单突变胚胎中有609个mRNA特异性上调，提示PUP-2在早期胚胎转录组调控中发挥主要作用。

3.2. 精子发生相关mRNA在pup突变成虫中差异表达

与配子缺陷表型一致，研究发现pup-1(0)和pup-1/-2(0)突变体中数百个精子发生相关mRNA表达异常，包括主要精子蛋白（major sperm protein, MSP）基因家族成员。其中msp-142 mRNA在pup-1/-2(0)成虫中表达量增加超过27倍，但对应的MSP-142::mCherry蛋白水平未见显著变化，表明可能存在翻译水平补偿机制。

3.3. 母源转录本丰度在pup胚胎中发生改变

胚胎转录组分析显示，pup-2(0)和pup-1/-2(0)突变体中63-66个"母源和合子"类别mRNA表达上调，其中包括全部79个核糖体大亚基和小亚基蛋白编码基因。这表明PUP活性可能通过调控核糖体蛋白mRNA稳定性影响胚胎发育。

3.4. 差异表达mRNA与siRNA的关联性分析

研究人员将先前获得的sRNA数据与本次mRNA测序结果进行关联分析，发现pup-1/-2(0)成虫中存在193对siRNA-mRNA同向变化对和95对反向变化对。特别值得注意的是，HRDE-1和WAGO-1 Argonaute蛋白靶标mRNA在pup-1(0)和pup-1/-2(0)突变体中显著富集，提示PUP-1可能通过调控这些小RNA通路影响基因表达。

3.5. GO分析揭示成虫和胚胎共享功能类别

基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析显示，尽管成虫和胚胎中差异表达的具体基因重叠较少，但神经元发育相关GO术语在两类样本中均显著富集，表明PUP活性可能在神经元功能调控中发挥重要作用。

3.6. PUP-1活性促进PGCs的建立和维持

通过活体成像技术，研究人员发现pup-1(0)和pup-1/-2(0)胚胎中经常仅存在一个表达GLH-1::GFP或PGL-1::GFP的PGCs。进一步追踪发现，这种"单PGC"表型主要由P4分裂失败引起，在pup-1/-2(0)胚胎中P4分裂失败率高达48%。

3.7. 单PGC表型与生育力降低相关

通过将胚胎按PGC数量分类并追踪至成虫期，研究发现具有两个PGCs的pup-1(0)和pup-1/-2(0)胚胎分别有78%和58%发育为可育成虫，而仅有一个PGCs的胚胎可育率分别降至29%和25%，表明P4分裂延迟与成虫不育显著相关。

3.8. PUP-1是体细胞PGL-1颗粒及时清除所必需的

研究发现pup-1(0)和pup-1/-2(0)胚胎体细胞中PGL-1颗粒数量显著增加。通过构建lgg-1(0);pup-1/-2(0)双突变体，发现自噬（autophagy）通路在pup突变体中仍部分功能正常，表明PGL-1颗粒积累可能源于RNA稳定性改变导致的颗粒屏蔽效应，而非自噬缺陷。

本研究首次系统阐明了PUP-1在秀丽隐杆线虫胚胎原始生殖细胞建立中的关键作用。研究发现，母源提供的PUP-1通过促进生殖系祖细胞P4分裂和维持生殖颗粒（germ granules）稳定性来保障PGCs正常形成，而P4分裂延迟会显著增加成虫不育风险。同时，PUP-1通过调控RNA稳定性限制体细胞PGL颗粒积累，这一功能独立于自噬通路。转录组分析进一步揭示PUP-2在胚胎核糖体蛋白mRNA调控中的独特作用，而PUP-1则更多参与成虫转录组维持。这些发现不仅拓展了对RNA尿苷化修饰在发育中功能的认识，也为理解温度胁迫下生殖系发育异常提供了新的分子视角。该研究建立的实验体系和分析方法为后续探究RNA修饰与细胞命运决定机制奠定了重要基础。