流式细胞术定量巴氏灭菌Akkermansia muciniphila MucT：方案优化与实验室间环形试验

《Food Bioscience》：Quantification of pasteurized Akkermansia muciniphila MucT by flow cytometry: protocol optimization and inter-laboratory ring test

本研究针对EFSA批准的全球首个后生元——巴氏灭菌Akkermansia muciniphila MucT在生产过程中缺乏标准化定量方法的难题，优化并验证了一种基于流式细胞术的绝对计数方案。研究人员通过优化样品制备（如选用含Tween 80的Mitsuoka缓冲液）有效减少细胞聚集，使该方法在六家实验室的环形试验中展现出高精密度（CV 12.3–24.1%）和准确度（Z值max=2.64），成功应用于工业质控中的质量平衡计算。该方案为后生元的标准化生产与质控提供了可靠工具。

　　

在追求健康的浪潮中，微生物组科学揭示了我们肠道内微小居民的巨大潜力。其中，Akkermansia muciniphila（嗜黏蛋白阿克曼菌）作为一种革兰氏阴性细菌，因其在维持代谢健康和肠道屏障完整性方面的突出作用而备受关注。特别值得一提的是，其巴氏灭菌形式（Akkermansia muciniphila Muc^T）已于2021年获得欧洲食品安全局（EFSA）批准作为新型食品，成为目前唯一获此批准的下一代有益菌，通常以每日摄入3.0 × 10¹⁰个细胞的剂量上市。这类灭活微生物或其成分被称为“后生元”（postbiotics），与传统的益生菌（probiotics）相比，具有更高的稳定性、安全性和更长的保质期等优势。

然而，机遇与挑战并存。后生元产业的蓬勃发展对生产过程的质量控制提出了更高要求，其中核心环节之一便是对微生物生物量的精确量化。不准确的计数可能导致产品批次间差异大、功效不稳定、资源浪费甚至监管不合规等问题。对于像巴氏灭菌A. muciniphila Muc^T这样的后生元，传统的平板计数法（CFU）因其已灭活而无法适用，而显微镜计数法（如Thoma chamber）则存在主观性强、耗时且在高浓度下准确性降低等局限性。流式细胞术（flow cytometry）作为一种快速、客观的细胞计数方法，在益生菌领域已有应用（如ISO 19344标准），但其标准方案主要针对乳酸菌等传统益生菌，对于像A. muciniphila这样具有细胞小、疏水性强、易聚集等特点的细菌，直接套用现有方法可能无法获得准确结果。因此，开发一种针对巴氏灭菌A. muciniphila Muc^T的标准化、可重复的流式细胞术定量方案，对于确保产品质量、推动产业发展至关重要。本研究旨在填补这一空白，相关成果发表在《Food Bioscience》上。

为开展本研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，他们使用了来自实验室培养以及CSL意大利和美国公司生产的工业化批次（包括用于环形试验的J1和J2批次）的巴氏灭菌A. muciniphila Muc^T冻干粉末作为样本。核心方法是基于ISO 19344 (2015) 标准Protocol B进行优化的流式细胞术定量方案，使用SYTO? 24和碘化丙啶（PI）对细胞进行双染色，并在Attune NxT/Attune CytPix和BD Accuri C6 Plus等流式细胞仪上进行检测和绝对计数（使用CountBright?作为参考）。同时，以Thoma计数板结合相差光学显微镜计数作为对比方法。此外，还采用了超声处理、不同稀释液（PBS与Mitsuoka缓冲液）比较、质量平衡计算以及涉及六个独立实验室的环形试验（ring test）来验证方法的可靠性和重现性。

3.1. 样品制备和方法优化的设置

研究人员首先尝试直接应用ISO19344标准中的Protocol B，使用PBS作为稀释液对巴氏灭菌A. muciniphila Muc^T进行流式细胞术分析。结果发现，在侧向散射光（SSC）对SYTO? 24荧光的散点图上，除了主细胞群外，还出现了一个明显的“彗星尾”状群体。通过结合声学聚焦和高亮视野摄像技术（Attune CytPix）对单个流式事件进行成像分析，证实主群体为单个细胞，而“彗星尾”群体则是由7-10个细胞组成的聚集体。细胞聚集会严重影响计数的准确性。虽然超声处理可以有效分散这些聚集体，但为了方案的普适性和简便性，研究人员转而寻求通过优化稀释液来解决。他们将稀释液从PBS更换为含有Tween 80表面活性剂的Mitsuoka缓冲液，并增加了稀释体积（1g样品稀释于100ml缓冲液）。结果表明，使用Mitsuoka缓冲液相比PBS能获得显著更高的细胞计数，且1:100的稀释比例比1:10的稀释比例计数结果更优，标准偏差（SD）和变异系数（CV%）更低。这初步确立了优化的样品制备方案。

3.2. 流式细胞术与Thoma计数板定量的比较

将优化后的流式细胞术与传统的Thoma计数板计数法进行对比。结果显示，对于测试的三个批次，流式细胞术均获得了比Thoma计数板更高的细胞计数。更重要的是，流式细胞术的SD和CV%显著低于Thoma计数板法，证明了其在精密度和准确性上的优势，减少了操作者主观性带来的误差。

3.3. 通过质量平衡验证不同样品的方法

在微生物生物量的工业化生产中，质量平衡计算是验证生产过程准确性的关键步骤。它涉及将高细胞密度批次（HB）按比例与辅料混合，以获得目标细胞剂量的标准化批次（SB）。研究人员将优化后的流式细胞术应用于HB和SB的计数，并将SB的实际测量值与基于HB计数的理论预期值进行比较。对三个不同SB和七个不同HB的分析表明，基于流式细胞术计数的质量平衡计算非常准确，SB的实际细胞密度与预期值的偏差百分比仅在1.0%至5.9%之间。这表明该优化方案能够可靠地用于工业化生产的过程控制。

3.4. 通过环形试验验证实验室对不同样品的检测性能

为了评估优化后的流式细胞术方案在不同实验室间的重现性（reproducibility）和稳健性（robustness），研究人员设计并执行了一个涉及六个独立实验室的环形试验。各实验室使用相同的优化方案对两个标准化批次（J1和J2）进行三次重复测定。结果表明，该方法具有良好的准确度和精密度。对于批次J1，各实验室的平均CV在1.2%至8.9%之间，总体CV为12.3%。对于批次J2，平均CV在4.3%至20.3%之间，总体CV为24.1%，若剔除异常值（outlier）后则降至13.4%。通过计算Z值（Z-score）来评估各实验室结果与数据集稳健均值的偏差，结果显示，除个别实验室因操作误差或样品不均一导致Z值略高（最大为2.67）外，绝大多数实验室的Z值均小于2，符合国际标准（ISO 13528:2022）的满意准则。这充分证明了该优化方案在不同实验室、不同操作人员和不同型号流式细胞仪上均能获得一致可靠的结果。

本研究成功优化并验证了一种用于定量巴氏灭菌Akkermansia muciniphila Muc^T的流式细胞术方案。该方案的关键优化点在于样品制备阶段使用Mitsuoka缓冲液作为稀释液并采用1:100的稀释比例，有效解决了A. muciniphila细胞易聚集的难题，从而提高了计数的准确性和精密度。与传统的Thoma计数板法相比，该方案显著降低了变异系数，展现出更高的可靠性。

该方案的成功应用不仅体现在其能够准确支持工业化生产中的质量平衡计算，确保了最终产品剂量的准确性，更重要的是，通过多实验室环形试验证明了其出色的重现性和稳健性。这意味着该方案可以被不同实验室广泛采纳，为巴氏灭菌A. muciniphila Muc^T乃至其他后生元产品的质量控制提供了一个标准化、高通量的分析工具。

这项研究的意义重大。它为解决后生元产业化过程中面临的定量难题提供了切实可行的解决方案，为保障产品质量、批次间一致性以及最终产品的安全性和有效性奠定了坚实的技术基础。随着后生元市场的不断扩大，此类标准化方法的建立对于推动整个行业的健康、规范发展具有里程碑式的意义。研究人员也指出，该方案经过适当调整（如缓冲液、复水时间和温度等参数的优化），有望应用于其他细胞型后生元的定量分析，展现出广阔的应用前景。