ETV4通过MARCH9介导的Mfn2泛素化调控线粒体功能促进卵巢癌生长的机制研究

《Cell Biology and Toxicology》：ETV4 promotes ovarian cancer growth by regulating mitochondrial function through Mfn2 ubiquitination mediated by the E3 ubiquitin ligase MARCH9

本研究针对卵巢癌(OC)中线粒体功能障碍的调控机制，发现转录因子ETV4通过靶向E3泛素连接酶MARCH9，介导线粒体融合蛋白Mfn2的K63连锁泛素化降解，从而破坏线粒体动力学平衡并促进肿瘤生长。该研究揭示了ETV4/MARCH9/Mfn2轴在OC进展中的新作用，为开发靶向线粒体质量的抗癌策略提供了理论依据。

　　

卵巢癌作为妇科恶性肿瘤中死亡率最高的疾病类型，其治疗面临巨大挑战。尽管铂类化疗初期效果显著，但多数患者最终会产生耐药性并复发。近年来，免疫检查点阻断等新型疗法的尝试也未能取得理想效果。这种治疗困境的背后，是人们对卵巢癌发生发展机制的认知仍存空白。

科学家们将目光投向了细胞的"能量工厂"——线粒体。在癌细胞中，线粒体不仅负责能量生产，还参与调控细胞死亡、信号传导等关键过程。线粒体通过不断分裂和融合维持动态平衡，这一过程被称为线粒体质量控。当平衡被打破，线粒体功能紊乱，就可能促进肿瘤进展。然而，在卵巢癌中，调控线粒体动态平衡的具体分子机制尚不明确。

在这项发表于《Cell Biology and Toxicology》的研究中，研究人员聚焦于转录因子ETV4——一个在多种癌症中高表达并促进肿瘤发展的关键因子。有趣的是，此前研究发现ETV4能与表皮生长因子受体(EGFR)启动子区结合，而线粒体EGFR参与生长因子诱导的线粒体融合过程。这提示ETV4可能通过某种机制影响线粒体功能，但具体通路仍有待阐明。

为了解开这一谜团，研究团队整合运用了生物信息学分析、基因沉默、蛋白质互作检测和动物模型等多种技术手段。他们从TCGA-OV数据库获取临床样本基因表达数据，使用人正常卵巢上皮细胞IOSE80和四种卵巢癌细胞系(SK-OV-3、HEY、A2780、OVCAR-3)进行体外实验，通过CCK-8、平板克隆形成实验评估细胞增殖，利用JC-1染色、ATP检测、MitoSOX荧光染色等方法分析线粒体功能，并借助裸鼠移植瘤模型验证体内效果。

ETV4高表达与卵巢癌细胞增殖和线粒体功能障碍相关

研究团队首先通过TCGA-OV数据分析发现，ETV4在卵巢癌组织中显著高表达。在细胞实验中也验证了这一结果：与正常卵巢上皮细胞IOSE80相比，四种卵巢癌细胞系中ETV4表达均升高，其中HEY和A2780细胞系差异最为明显，因此被选为后续研究模型。

当研究人员利用短发夹RNA(shRNA)技术沉默ETV4后，发现卵巢癌细胞的增殖能力明显受到抑制。更引人注目的是，线粒体功能指标也发生显著变化：ATP水平和线粒体膜电位升高，而线粒体DNA(mtDNA)和线粒体活性氧(mtROS)水平下降。这些结果提示ETV4不仅促进卵巢癌细胞增殖，还参与调控线粒体功能。

ETV4调控线粒体融合过程

线粒体的动态平衡由分裂和融合过程共同维持。研究人员检测了相关标志蛋白的表达情况，发现ETV4沉默后，线粒体融合相关蛋白Mfn1、Mfn2和OPA1表达增加，而分裂相关蛋白DRP1、MFF和FIS1表达下降，其中Mfn2的变化最为显著。通过MitoTracker染色观察线粒体形态，发现ETV4沉默导致线粒体过度伸长，呈现融合状态。这表明ETV4通过抑制线粒体融合过程影响线粒体动力学平衡。

ETV4通过E3泛素连接酶MARCH9调控Mfn2蛋白水平

一个关键问题是：ETV4如何影响Mfn2蛋白表达？研究人员发现，虽然ETV4沉默显著提升Mfn2蛋白水平，但Mfn2的mRNA水平并无明显变化。这表明ETV4并非通过转录调控，而是可能通过翻译后修饰影响Mfn2。

研究团队将目光投向泛素-蛋白酶体系统。通过生物信息学预测，他们筛选出10个可能靶向Mfn2的E3泛素连接酶，并发现ETV4沉默后，MARCH9和NEDD4L在mRNA和蛋白水平均下降。染色质免疫沉淀(ChIP)和荧光素酶报告基因实验进一步证实，ETV4能够直接结合MARCH9启动子区域并调控其转录。这些结果说明ETV4通过靶向MARCH9调控Mfn2蛋白稳定性。

Mfn2通过K63连锁泛素化经自噬-溶酶体途径降解

接下来，研究团队深入探究了MARCH9介导的Mfn2降解机制。当使用溶酶体抑制剂CQ处理细胞时，Mfn2蛋白水平显著积累，而蛋白酶体抑制剂MG132处理则无此效果，表明Mfn2主要通过自噬-溶酶体途径降解。

通过免疫共沉淀实验，研究人员发现MARCH9介导的Mfn2泛素化主要为K63连锁类型，而非常见的K48连锁类型。进一步实验表明，MARCH9的RING结构域是介导这一过程的关键。此外，研究还发现Mfn2与选择性自噬受体SQSTM1存在相互作用，且MARCH9过表达会增强这种相互作用，促进Mfn2通过SQSTM1介导的选择性自噬途径降解。

MARCH9通过Mfn2调控卵巢癌细胞线粒体功能

为验证MARCH9是否通过Mfn2影响线粒体功能，研究人员同时沉默MARCH9和Mfn2。结果发现，单独沉默MARCH9可提升ATP水平和线粒体膜电位，降低mtDNA和mtROS水平，而同时沉默Mfn2则逆转了这一效应。细胞增殖实验也显示类似趋势，表明MARCH9确实通过调控Mfn2影响卵巢癌细胞线粒体功能和增殖。

ETV4通过MARCH9/Mfn2信号轴影响线粒体功能

通过同时干预ETV4和MARCH9，研究人员进一步验证了完整的信号通路。ETV4沉默可提升Mfn2蛋白水平，增强线粒体功能，抑制细胞增殖；而MARCH9过表达则能逆转ETV4沉默的效应。这证明ETV4通过MARCH9/Mfn2信号轴调控线粒体功能。

ETV4沉默抑制体内卵巢癌生长

在动物实验中，沉默ETV4的卵巢癌细胞移植到裸鼠体内后，肿瘤体积和重量显著减小，细胞凋亡增加，增殖标志物Ki67表达下降。肿瘤组织中线粒体形态分析显示，ETV4沉默促进线粒体融合，mtROS和mtDNA水平降低，与体外实验结果一致。

本研究系统阐明了ETV4在卵巢癌中的新作用机制：ETV4通过转录调控E3泛素连接酶MARCH9，介导Mfn2的K63连锁泛素化修饰，进而通过SQSTM1介导的选择性自噬途径促进Mfn2降解，破坏线粒体融合-分裂平衡，最终促进卵巢癌进展。

这一发现不仅深化了对卵巢癌线粒体功能障碍机制的理解，还为开发新的治疗策略提供了潜在靶点。靶向ETV4/MARCH9/Mfn2信号轴，可能有望通过恢复线粒体动态平衡，抑制卵巢癌的生长和进展。未来研究可进一步探索该通路在卵巢癌耐药性中的作用，以及靶向该通路的治疗潜力。