三菌株益生菌组合通过MAPK信号通路与肠道菌群调节改善慢传输型便秘的机制研究

《Frontiers in Pharmacology》：Therapeutic effects of three-strain probiotic combination on slow transit constipation: mechanistic insights into MAPK signaling pathway and gut microbiota restoration

本综述系统阐述了三菌株益生菌组合（Golden Bifid）通过调节MAPK信号通路、5-羟色胺（5-HT）信号及其受体（5-HT3R、5-HT4R）、肠道 Cajal 间质细胞（ICC）标志物c-kit表达，并恢复肠道菌群平衡，从而改善洛哌丁胺（LOP）诱导的慢传输型便秘（STC）的多组学机制，为临床益生菌治疗STC提供了新的理论依据。

　　

引言

慢传输型便秘（Slow Transit Constipation, STC）是一种常见的功能性便秘亚型，其特征是肠道蠕动减少，导致粪便在结肠中通过延迟。其临床症状包括大便干燥、排便间隔时间延长和排便困难。研究表明，饮食习惯改变、生活方式变化以及全球人口老龄化等因素导致STC发病率逐年上升，对患者的身心健康产生深远影响，并加重了医疗系统的经济负担。STC的发病机制复杂且多因素参与，涉及肠神经系统（Enteric Nervous System, ENS）功能障碍、Cajal间质细胞（Interstitial Cells of Cajal, ICC）数量与功能异常、神经递质和激素（如5-羟色胺，5-HT）水平改变、肠道菌群失调、肠道平滑肌收缩异常、遗传因素以及环境和生活方式影响。近年来，益生菌在STC治疗中显示出巨大潜力，其通过调节肠道菌群、代谢产物和神经递质，最终改善肠道蠕动并缓解便秘症状。三菌株益生菌组合（Golden Bifid）是一种含有长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的益生菌制剂，广泛应用于调节肠道菌群和缓解与肠道菌群失调相关的症状。然而，其在治疗STC方面的具体分子机制尚未完全阐明。本研究首次利用RNA测序和16S rDNA测序技术，探讨Golden Bifid对洛哌丁胺（Loperamide, LOP）诱导的STC大鼠模型的治疗效果并阐明其潜在分子机制。

材料与方法

本研究使用36只SPF级雄性Wistar大鼠，随机分为6组：对照组、LOP模型组、LOP+低剂量Golden Bifid组（LOP + Golden Bifid-L）、LOP+中剂量Golden Bifid组（LOP + Golden Bifid-M）、LOP+高剂量Golden Bifid组（LOP + Golden Bifid-H）以及LOP+普芦卡必利片（Prucalopride Succinate Tablets, PST）阳性对照组。通过灌胃给予LOP（3 mg/kg/天，连续21天）建立STC模型。从第8天开始，各治疗组在每次LOP给药1小时后分别给予不同剂量的Golden Bifid（低剂量0.27 g/kg/天，中剂量0.54 g/kg/天，高剂量1.08 g/kg/天）或PST（0.18 mg/kg/天），连续干预14天。对照组和LOP组给予等体积无菌生理盐水。实验结束后，检测排便频率、粪便含水量、肠道传输速率，并进行结肠组织苏木精-伊红（H&E）染色观察病理变化。采用免疫组织化学（IHC）法检测结肠组织中c-kit、5-HT、5-HT3R、5-HT4R以及磷酸化ERK（p-ERK）和总ERK蛋白的表达。利用RNA测序（RNA-seq）技术分析结肠组织的转录组变化，并通过16S rDNA测序分析粪便微生物群落结构。

结果

Golden Bifid对STC大鼠临床表现的影响

与对照组相比，LOP模型组大鼠结肠内粪便颗粒少而硬，盲肠内容物增多，排便频率、粪便含水量和肠道传输速率均显著降低。H&E染色显示LOP组结肠黏膜结构紊乱，肠腺排列不整齐，上皮细胞脱落，黏膜层和肌层厚度显著变薄。经不同剂量Golden Bifid或PST治疗后，上述便秘相关表型均得到显著改善，结肠组织病理损伤明显恢复，效果与PST阳性药组相当。

Golden Bifid对STC大鼠肠道Cajal间质细胞c-kit蛋白表达的影响

IHC分析显示，与对照组相比，LOP组结肠组织中ICC标志物c-kit蛋白的表达显著降低。而经过不同剂量Golden Bifid或PST治疗后，c-kit的表达均显著上调，表明Golden Bifid可能通过促进ICC的功能和维持其数量来改善结肠动力。

Golden Bifid对STC大鼠肠道组织中5-HT及其受体表达的影响

IHC结果显示，LOP诱导的STC大鼠结肠组织中5-HT、5-HT3R和5-HT4R的阳性表达面积均显著减少。Golden Bifid干预后，这些关键信号分子的表达均得到显著恢复，提示Golden Bifid可通过增强5-HT信号通路来改善STC相关的肠道动力障碍。

Golden Bifid通过RNA测序对STC大鼠肠道组织差异表达转录本及通路的影响

RNA测序分析表明，与LOP组相比，中剂量Golden Bifid干预导致1998个差异表达转录本，其中899个上调，1099个下调。KEGG通路富集分析显示，这些差异表达转录本显著富集于MAPK信号通路、TNF信号通路、雌激素信号通路等。进一步验证发现，与对照组相比，LOP组中FLNC、HSPB1、HSPA1B、PIK3CB、CREB3L4和BIRC3等MAPK通路相关基因的mRNA表达显著下调，而Golden Bifid干预可显著上调其表达。IHC分析证实，LOP组p-ERK表达升高，Golden Bifid治疗可抑制MAPK信号通路的过度激活。

Golden Bifid对STC大鼠结肠微生物群落的影响

16S rDNA测序分析显示，与对照组相比，LOP组肠道菌群α多样性（Shannon指数和Simpson指数）显著降低，β多样性分析也表明微生物群落结构发生显著改变。在门水平上，LOP导致厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度增加，拟杆菌门（Bacteroidota）减少，而髌骨细菌门（Patescibacteria）的相对丰度显著降低。Golden Bifid干预可部分逆转这种菌群失调，恢复微生物多样性和群落结构，使其更接近于对照组。在属水平上，Golden Bifid处理降低了有害菌如Blautia、Dubosiella、UCG-008、Lachnoclostridium、Phascolarctobacterium等的相对丰度，同时促进了有益菌如Lachnospiraceae_ND3007_group、Alloprevotella和Candidatus_Saccharimonas的生长。

讨论

本研究首次通过多组学方法系统阐述了三菌株益生菌组合Golden Bifid缓解STC的分子机制。结果表明，Golden Bifid不仅能显著改善STC大鼠的便秘症状和结肠组织病理损伤，还能通过多靶点发挥作用：上调ICC标志物c-kit的表达以改善肠道起搏功能；增强5-HT信号通路（包括5-HT、5-HT3R、5-HT4R）以促进肠道蠕动；调节MAPK等关键信号通路以影响细胞功能；并有效恢复肠道菌群平衡，增加有益菌，抑制有害菌。这些发现为Golden Bifid的临床应用提供了坚实的实验和理论依据，展示其作为一种多维度治疗STC的潜力。然而，将小鼠模型中的发现直接转化应用于人类仍需谨慎，未来需要精心设计的长期临床试验来验证其对人体的有效性和安全性。

结论

本研究证实，三菌株益生菌组合Golden Bifid通过协同调节宿主转录组谱（特别是MAPK和5-HT信号通路）以及恢复肠道菌群组成和多样性，对慢传输型便秘具有显著的治疗潜力。其多靶点作用机制为开发STC的新型治疗策略提供了重要的理论支持和实验证据。