综述：水稻铵态氮和硝态氮吸收利用的调控网络

《Frontiers in Plant Science》：Regulatory network of ammonium and nitrate uptake and utilization in rice

本综述系统梳理了水稻氮素吸收利用的关键基因与调控网络，重点阐述了铵转运蛋白（AMT）和硝酸盐转运蛋白（NRT/NPF）的功能及其在氮素转运、同化过程中的核心作用，并探讨了通过多基因聚合策略（如OsAMT1.2×OsGS1.2×OsAS1）协同提高氮肥利用效率（NUE）的分子育种潜力，为培育高产高效水稻品种提供了重要基因资源和理论依据。

　　

1 引言

氮（N）是生命元素，作为核酸、酶、氨基酸和蛋白质的关键组分，对作物生长发育、产量和品质形成至关重要。然而，氮肥过量施用不仅增加经济成本，还导致严重的环境问题。因此，阐明作物氮肥利用效率（NUE）的遗传基础，培育高产且氮高效品种，对减少氮肥需求、促进农业可持续发展具有重要意义。植物高效吸收利用氮素涉及多个过程：根系从土壤吸收不同形态氮素（无机氮如NH₄⁺和NO₃^-，有机氮如氨基酸）；氮素在植物体内运输转化；最终通过各种酶的作用被同化。这是一个复杂的、受多因素调控的过程。水稻作为淹水作物，主要吸收NH₄⁺，但土壤中部分NH₄⁺经硝化作用转化为NO₃^-，后者亦可被水稻吸收，约占其总吸氮量的25-40%。为应对土壤溶液中氮离子浓度的异质性和动态变化，植物进化出高亲和力运输系统（HATS）和低亲和力运输系统（LATS）来协同调控氮的吸收与分配。

2 水稻中NH₄⁺转运蛋白的功能

水稻基因组中已鉴定出至少12个潜在的铵转运蛋白（AMT），分为OsAMT1、OsAMT2、OsAMT3、OsAMT4和OsAMT5五个亚家族。其中，OsAMT1亚家族（包括OsAMT1.1、OsAMT1.2、OsAMT1.3）作为高亲和力转运蛋白，在低NH₄⁺浓度下发挥作用；而OsAMT2、OsAMT3、OsAMT4家族则属于低亲和力转运蛋白，主要在高NH_{4+浓度下活跃。研究表明，OsAMT1.1、OsAMT1.2、OsAMT1.3、OsAMT2.1和OsAMT5.1均具有NH4⁺转运能力。}

OsAMT1.1在氮吸收利用中起核心作用，能在低和高NH₄⁺条件下显著促进NH₄⁺吸收，维持氮-钾（N-K）稳态，并在亚适宜至适宜氮供应下提高NUE、植物生长和谷物产量。OsAMT1.2与谷氨酸合成酶基因（OsGOGAT1）同时激活可提高耐低氮能力，增强整株水平的NH₄⁺吸收和氮再动员。相反，OsAMT1.3的过表达会导致碳（C）-氮代谢失衡，引起植株生长不良和减产。AMT基因的表达具有组织和氮响应特异性，其调控不仅限于氮吸收，还可能参与氮同化、转运及其他氮相关代谢过程。

3 水稻中NO₃^-转运蛋白的功能

硝酸盐（NO₃^-）的吸收是一个由H⁺/NO₃^-协同转运蛋白驱动的主动过程。水稻中的NO₃^-转运蛋白主要分为低亲和力的NRT1/PTR（NPF）家族和高亲和力的NRT2/NAR2家族。

NRT1/PTR家族在水稻中约有93个成员，功能各异。OsNRT1.1A（OsNPF6.3）受NH₄⁺诱导表达，能显著上调多种NO₃^-和NH₄⁺利用相关基因的表达，过表达可提高NUE和谷物产量，并缩短水稻生育期。OsNRT1.1B（OsNPF6.5）是水稻NRT1家族中唯一具有双亲和力转运特性的成员，其等位基因变异是导致籼稻（indica）和粳稻（japonica）亚种间NUE差异的重要原因之一。OsNRT1.1C（OsNPF6.4）等功能亦被研究。其他成员如OsNPF2.2参与NO₃^-从木质部卸载；OsNPF2.4（OsNRT1.6）是pH依赖性低亲和力转运蛋白，参与NO₃^-吸收、长距离运输和再分配；OsNPF3.1的编码区突变影响野生稻和栽培稻的NUE差异；OsNPF4.5是丛枝菌根特异性NO₃^-转运蛋白，约占菌根NO₃^-吸收的45%；OsNPF6.1具有单倍型差异，其HapB单倍型能增强NO₃^-吸收并提高NUE，同时还能通过上调硝酸还原酶（OsNR2）表达促进一氧化氮（NO）生物合成，增强病毒抗性。OsNPF7和OsNPF8亚家族部分成员在调控分蘖、产量和NUE方面也发挥重要作用。

高亲和力NO₃^-转运系统（HATS）对水稻氮吸收至关重要。目前已鉴定出5个NRT2（OsNRT2.1, OsNRT2.2, OsNRT2.3a, OsNRT2.3b, OsNRT2.4）和2个NAR2（OsNAR2.1, OsNAR2.2）成员。OsNRT2.3通过mRNA剪接产生OsNRT2.3a和OsNRT2.3b两个转录本，前者主要根部表达且受NO₃^-诱导，参与根到茎的NO₃^-长距离运输；后者主要地上部表达，高表达可增强pH缓冲能力，改善氮、铁、磷的吸收。OsNAR2.1与OsNRT2.1/2.2和OsNRT2.3a互作介导NO₃^-吸收。内质网（ER）定位的OsNAR2.2最近被证明调控NO₃^-从根到茎的运输，并控制小穗数、产量和NUE。OsNRT2.4是双亲和力NO₃^-转运蛋白，参与调控根和茎间的NO₃^-吸收和分配。

NO₃^-不仅是营养元素，也是信号分子。OsNRT1.1B被证实可感知外部NO₃^-信号。研究表明，OsNRT1.1B与磷酸盐信号抑制子OsSPX4发生物理相互作用；NO₃^-的存在增强这种相互作用并促进E3泛素连接酶NBIP1的招募，导致OsSPX4泛素化降解。核心NO₃^-信号转录因子NLP3也受SPX4调控。这一OsNRT1.1B-OsSPX4-OsNLP3调控模块填补了质膜NO₃^-感知与核内下游NO₃^-响应之间的空白。

4 调控水稻氮肥利用效率的关键基因

通过数量性状位点（QTL）定位和图位克隆，在现代水稻品种中鉴定出多个控制NUE的关键基因，如OsNRT1.1B、OsNR2、DNR1和OsWRKY23。籼稻中的OsNRT1.1B和OsNR2对NUE和谷物产量的改善显著优于粳稻。生长素响应因子OsARFs介导生长素对氮代谢的促进作用，DNR1参与生长素稳态调控，反映了籼粳稻在NO₃^-吸收、氮同化和产量增强方面的差异。RNR10编码的F-box蛋白与DNR1互作，通过单泛素化DNR1抑制其降解，从而拮抗生长素积累，导致根系对氮和NO₃^-吸收的响应性降低。SOD5直接结合DNR1启动子激活其表达，进一步抑制生长素积累。敲除SOD5可显著提高NUE和谷物产量，尤其在低氮条件下。OsWRKY23是调控籼粳稻NO₃^-吸收速率和NUE差异的关键因子，籼稻型OsWRKY23对DNR1的转录激活能力降低，导致较高生长素水平、改善的NO₃^-吸收同化及最终增强的NUE和产量。

不同品种因其对氮供应的敏感性差异而表现出发育差异，如根长、生物量和产量。通过分析这些性状在不同氮水平下的表型值或比值，利用图位克隆鉴定了调控氮调控植物生长的遗传位点，如MYB61。转录因子MYB61受生长调节因子4（GRF4）调控，协调纤维素生物量生产和氮利用。籼稻型MYB61等位基因表现出强转录活性，在减氮供应下比粳稻型等位基因具有更高的NUE和谷物产量。

基因组关联分析（GWAS）也定位了一些氮高效基因。例如，利用NUE相关农艺性状的GWAS鉴定出源于野生稻变异的OsNPF6.1HapB优良等位变异，该等位基因被NAC42转录激活，增强氮吸收能力并在低氮条件下提高NUE。通过对水稻自然群体NUE相关性状（有效穗数和单株产量）进行GWAS，结合高氮和低氮条件下的转录数据，鉴定出转录因子OsNLP4可调控NUE，同时能促进亚硝酸还原酶基因OsNiR及氮转运相关基因（NRTs和AMT1.1）的转录，实现水稻氮吸收与同化的协同调控。OsNLP3和OsNLP4在细胞中的定位受NO₃^-供应水平影响，施用NO₃^-使其从细胞质向细胞核转移，表明它们是水稻氮信号通路的核心调控因子。

利用多亲本高级世代互交（MAGIC）群体，对高氮和低氮条件下NUE相关性状（分蘖）进行GWAS，鉴定出OsSTP28是水稻氮响应分蘖和产量形成的关键调控因子。对水稻氮响应分蘖的GWAS鉴定出调控因子OsTCP19；其启动子中的一个29-bp插入缺失代表了一种自然变异，决定了不同水稻品种在低氮条件下的分蘖数。OsTCP19作为分蘖对氮响应的调节因子，通过其对氮的转录响应及其对促分蘖基因DWARF AND LOW-TILLERING（DLT）的靶向作用实现调控，OsLBD37/39-OsTCP19-DLT通路是调控水稻氮响应和分蘖的关键级联。此外，转录因子OsGATA8被鉴定为水稻氮吸收和分蘖形成的关键调控因子。OsGATA8通过抑制OsAMT3.2转录负调控氮吸收，同时通过抑制负分蘖调控因子OsTCP19的转录促进分蘖形成。OsGATA8H单倍型表现出高NUE，具有增强的氮吸收和更高的有效分蘖比例。

通过突变体鉴定也克隆了一些NUE相关基因，如ARE1、ARE4、OsELF3-1和OsDOF18。ARE1是氮同化的负调控因子，编码一个定位于叶绿体的蛋白，其转录受Ghd7抑制。ARE1功能缺失突变导致衰老延迟和谷物产量增加，从而在低氮条件下增强NUE。OsELF3–1与OsELF4s和OsLUX形成三元复合物（OsEC），抑制Ghd7表达，进而直接抑制ARE1表达并促进氮吸收。ARE4是一个MYB相关转录因子，协调葡萄糖信号与NUE。它与葡萄糖传感器OsHXK7互作被保持在细胞质中。感知葡萄糖信号后，ARE4被释放并转运入核，激活一组高亲和力NO₃^-转运蛋白基因的表达，导致NO₃^-吸收和积累增加。在osdof18突变体中，OsAMT1.1、OsAMT1.3、OsAMT2.1和OsAMT4.1的表达降低，表明这些NH₄⁺转运蛋白基因在转录因子OsDOF18的下游起作用。研究证明OsDOF18介导NH₄⁺运输和氮分配，从而影响NUE。

维持细胞pH稳态对实现水稻高NUE至关重要。植物过量吸收NH₄⁺导致细胞酸化，而过量吸收NO₃^-导致细胞碱化，影响酶功能并最终影响作物生长和产量。过表达氮转运基因OsNRT2.3b有助于抵消水稻植株的pH变化，从而提高NUE和产量。质膜（PM）H⁺-ATPase通过将H⁺泵出细胞，促进多种营养物质（如NO₃^-、磷Pi和K）的运输并维持胞质H⁺稳态。过表达水稻质膜H⁺-ATPase 1（OSA1）可增强NH₄⁺吸收和同化，导致谷物产量和NUE增加。根细胞中NH₄⁺的同化需要碳骨架作为谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶（GS/GOGAT）循环合成氨基酸的底物。同化一分子NH₄⁺在细胞质中产生两分子H⁺，抑制植物根系生长发育并降低NUE。最近研究鉴定出一个突变体，由于编码精氨琥珀酸裂解酶（ASL）的基因发生错义突变，其对NH₄⁺表现出根超敏性，该酶定位于质体，通过将过量谷氨酰胺转化为精氨酸来缓解NH₄⁺诱导的根伸长抑制。水稻籼粳亚种间ASL等位基因的自然变异表明，ASL表达与NUE和产量呈正相关。这些结果表明，缓解NH₄⁺同化过程中产生的H⁺的管理可以提高水稻NUE。

其他关键调控基因亦被鉴定。通过RNA-seq鉴定出转录因子OsDREB1C受光和低氮供应共同诱导，直接靶向OsNR2、OsNRT2.4和OsNRT1.1B，同时增强光合作用和NUE，显著提高水稻产量。通过生化筛选鉴定的bZIP转录因子OsRF2b与OsbZIP61形成异源二聚体，该复合物直接结合OsNRT1.1B启动子区域并抑制其表达，作为NUE和谷物产量的负调控因子。OsNR1.2编码NADH依赖性硝酸还原酶，对实现水稻高NUE至关重要。此外，还鉴定出一批参与NUE的关键基因，如水稻OsBT1、OsBT2和AAP基因，通过改变这些基因的表达水平可以提高作物产量和NUE。

剖析“绿色革命”品种（GRVs）中的NUE通路，为挖掘氮高效基因提供了有效途径。“绿色革命”基因sd1编码赤霉素合成途径中的重要合成酶GA20氧化酶2（GA20ox2）。sd1突变型导致内源赤霉素活性降低和赤霉素信号抑制子DELLA蛋白（SLR1）积累，从而降低水稻株高。水稻转录因子GRF4与转录激活因子GIF1互作，促进氮转运和同化相关基因（如OsAMT1.1、OsGS1.2、OsNRT1.1B）的表达。SLR1竞争性抑制GRF4-GIF1相互作用，抑制GRF4-GIF1蛋白复合物形成，导致水稻NUE降低。将优良等位基因GRF4ngr2导入半矮秆高产水稻品种，可在不改变株高的情况下协同提高产量和NUE。独脚金内酯信号的关键抑制子D53与GRF4互作，阻止GRF4结合其靶基因启动子，负调控NUE。随后研究发现，NGR5是GA-GID1介导的蛋白酶体降解的新靶标，而SLR1与NGR5竞争与GID1相互作用。在GRVs中，稳定的SLR1促进NGR5的稳定，从而解释了GRVs分蘖增加的原因。氮状态通过组蛋白修饰影响染色质功能，此过程中转录因子NGR5招募多梳抑制复合物2（PRC2），通过抑制性H3K27me3修饰抑制分蘖基因（包括OsD14和OsSPL14）。此外，将sd1优良NGR5等位基因聚合可增强NUE，导致氮肥用量减少和谷物产量增加，且不影响有益的半矮秆性状。这表明操纵植物发育和NUE共调控将推动可持续粮食安全的现代育种。

5 结论与未来展望

过去二十年，水稻氮利用调控最重要的进展之一是鉴定了NO₃^-和NH₄⁺转运蛋白以及参与NUE的转录因子。相比NO₃^-转运蛋白取得的实质性进展，NH₄⁺转运蛋白在改善NUE方面的进展相对有限。AMT家族中，仅OsAMT1.1和OsAMT1.2被确认能提高NUE。

水稻种质资源中存在显著的NUE遗传变异，为精准育种提供了宝贵基础。在水稻驯化过程中，鉴定了几个关键位点基因的自然变异，它们在调控NUE及导致籼粳稻产量差异方面发挥重要作用。未来仍需进一步剖析水稻种质资源间NUE变异的候选基因。GWAS已克隆多个关键NUE调控基因，它们在变化氮条件下增强水稻氮吸收、同化和分蘖能力，从而提高NUE和谷物产量，为水稻NUE分子改良提供了重要遗传资源。

尽管已陆续鉴定和表征了参与氮吸收、运输和利用的关键基因，但单个基因对改善氮吸收或NUE的效果仍然有限。采用多基因共调控策略可进一步提高水稻NUE和产量。研究表明，共过表达氮运输、吸收和同化基因可同时增加水稻产量和NUE。例如，OsNPF8.9a×OsNR2、OsAMT1.2×OsGS1.2×OsAS1和OsGS2×OsAS2×OsANT3组合分别优化了NO₃^-吸收、NH₄⁺转化和氮循环。其中，OsAMT1.2、OsGS1.2和OsAS1的过表达组合代表了一种有前景的育种策略。

展望未来，此类多基因策略的成功将极大受益于先进生物技术工具的整合。基于CRISPR/Cas的多重基因组编辑允许对多个靶基因进行精确同步修饰，而转基因叠加技术则能实现基因盒的协调表达。结合高通量表型组学和组学辅助选择，这些方法为合理设计具有增强NUE和产量潜力的水稻品种提供了强大框架。这种系统水平的育种策略为在保持高生产力的同时减少氮肥投入提供了一条有效路径，有助于实现更可持续和环境友好的水稻生产。

在全球气候变化和田间条件日益多变的背景下，水稻NUE的调控不仅需要在最佳环境下理解，还需在非生物胁迫条件下进行。近期研究表明，氮吸收和同化不仅受遗传调控，而且高度响应环境线索。在干旱、盐碱和极端温度等非生物胁迫下，氮转运蛋白表达和硝酸还原酶活性或其他参与氮代谢的酶常受到抑制，导致NUE降低。然而，关键基因的应用已显示出在胁迫条件下改善NUE的巨大潜力。例如，DST-OsNR1.2调控模块被证明参与干旱耐受条件下NO₃^-同化的抑制。鉴于DST负调控气孔关闭而正调控氮同化，它可能介导了氮代谢与气孔运动之间的耦合。这一机制为开发具有改良NUE的耐旱作物提供了一个有前景的靶标。OsDREB1C是AP2/EREBP转录因子家族成员，最初因其在水稻冷胁迫响应中的作用而被识别，近期研究表明过表达OsDREB1C可缩短生育期、增强NUE并促进更有效的资源分配，暗示了胁迫响应通路与营养效率之间存在潜在的调控联系。

此外，农艺措施如灌溉制度、施肥策略和土壤改良剂会影响关键氮相关基因的表达和功能，从而影响作物NUE。在水稻田中，NO₃^-和NH₄⁺有效性在时间和空间上波动显著，需要根系响应多样且变化的环境信号。研究发现NO₃^-供应能增强水稻对NH₄⁺的吸收。因此，更深入地理解NO₃^-和NH₄⁺之间的相互作用及其在氮吸收的生理生化调控中的作用，对改善NUE至关重要。总之，对遗传调控网络与管理措施之间动态相互作用的系统理解，将为在多变环境条件下制定既高产又环境可持续的氮管理策略提供理论基础和实践指导。

综上所述，本文概述了参与NO₃^-和NH₄⁺运输的遗传调控因子，它们有助于高效氮吸收和转运。我们进一步讨论了调控水稻NUE的关键基因，强调了它们在显著提高作物产量和NUE方面的潜力。尽管在理解水稻NUE的遗传结构和分子机制方面取得了实质性进展，但我们对调控NUE的复杂遗传网络的认识仍存在显著差距。这需要通过先进的基因组技术和生物信息学工具深入探索影响NUE的基因和调控元件。未来的研究应聚焦于阐明这些基因的功能、它们的相互作用以及它们在变化氮素有效性下对不同环境条件的响应。最终，通过利用多基因聚合、信号调控网络深度分析和优良遗传资源挖掘等策略，有望进一步提高水稻NUE，促进高产、环境可持续水稻品种的培育。