基于无膜细胞器的整合分析构建免疫相关预后特征并鉴定NRG1作为结直肠癌新型甲基化生物标志物

《Frontiers in Immunology》：Membraneless organelles-based integrative analysis constructs an immune-related prognostic signature and identifies NRG1 as a novel methylation biomarker in colorectal cancer

本综述通过整合无膜细胞器（MLO）相关基因的转录组数据，构建了结直肠癌（CRC）预后风险评分模型（MPRS），系统揭示了其与肿瘤免疫微环境（TIME）、免疫治疗响应及化疗敏感性的关联。研究首次鉴定NRG1作为关键MLO相关基因，证实其启动子甲基化是表达下调的核心机制，并通过体外实验验证其相分离（LLPS）潜能与临床预后价值，为CRC的精准分群和靶向治疗提供了新型生物标志物。

　　

1 引言

结直肠癌（CRC）作为全球第三大癌症相关死因，其患者预后和治疗响应存在显著异质性。近年来，无膜细胞器（MLO）通过液体-液相分离（LLPS）调控亚细胞结构的功能在肿瘤发生中的作用逐渐被揭示，但MLO在CRC预后和肿瘤免疫微环境（TIME）中的具体机制尚不明确。神经调节蛋白1（NRG1）作为表皮生长因子受体（EGFR）通路配体，在CRC中呈现与经典致癌通路相悖的保护性作用，提示其可能通过新型分子机制参与疾病进程。

2 方法

研究整合TCGA、GEO等公共数据库的转录组、突变、甲基化及单细胞数据，通过共识聚类识别CRC的MLO相关亚型。利用LASSO回归构建MLO相关预后风险评分（MPRS），并通过多组学分析验证其与临床病理特征、基因组不稳定性、TIME模式、免疫检查点抑制剂（ICI）响应及化疗敏感性的关联。针对关键基因NRG1，采用PONDR、FuzDrop等工具预测其LLPS倾向，并通过qRT-PCR、免疫组化（IHC）及5-氮杂-2′-脱氧胞苷（Aza）去甲基化实验进行体外验证。

3 结果

3.1 MLO相关基因表达与预后价值

在CRC组织中共鉴定722个MLO相关差异表达基因（DEG），其中70个与预后显著相关。功能富集分析显示这些基因主要参与细胞周期调控、凋亡信号负调控等通路。蛋白互作网络揭示了MLO相关DEG间的复杂调控关系。

3.2 MLO亚型识别

基于70个预后相关MLO-DEG的共识聚类将CRC患者分为MC1和MC2两种亚型。MC2亚型呈现更高的肿瘤突变负荷（TMB）、微卫星不稳定性（MSI）及新抗原负荷，且与不良预后相关。

3.3 MPRS模型构建与验证

MPRS模型包含CDC25C、NRG1、DMPK、TIGD1、TIMP1和ATP2A1六个基因。高风险MPRS组患者总生存期显著缩短，且模型在多个独立队列中验证良好。PONDR分析提示这些蛋白均含内在无序区域（IDR），其中NRG1具有最高LLPS倾向。

3.4 MPRS与TIME模式及生态型关联

高风险MPRS组显示更高的免疫/基质评分，且单细胞测序揭示其与单核/巨噬细胞状态09正相关。空间转录学分析发现肿瘤-基质交界处巨噬细胞浸润显著，生态型分析表明MPRS与CE7生态型密切相关。

3.5 MPRS预测免疫治疗疗效

高风险MPRS组具有更高的TIDE、TMB、MSI评分及CD8⁺ T细胞功能障碍特征。在IMvigor210等免疫治疗队列中，MPRS可有效区分响应与非响应患者。

3.6 MPRS与化疗敏感性

高风险MPRS组对5-氟尿嘧啶（5-Fu）和伊立替康敏感性降低，而低风险组可能从5-Fu联合ICI治疗中获益。GDSC/CTRP数据库筛选出多个MPRS相关小分子抑制剂。

3.7 NRG1的相分离潜能与表达特征

NRG1在CRC细胞系及组织中表达显著下调，其低表达与不良预后相关。AlphaFold结构预测显示NRG1包含大量IDR区域，FuzDrop评分证实其强LLPS倾向。KRAS突变型CRC中NRG1表达下调且应激颗粒（SG）活性增强。

3.8 NRG1的多组学功能解析

NRG1表达与抑癌蛋白（FOXO3A、SMAD4等）正相关，与致癌蛋白（β-catenin、AKT等）负相关。通路分析表明NRG1可能通过抑制mTOR/PI3K通路发挥保护作用。

3.9 NRG1甲基化调控机制

16个CpG位点甲基化与NRG1表达呈负相关。Aza处理可逆转CRC细胞中NRG1的表达抑制。DepMap数据分析提示NRG1高甲基化与西妥昔单抗耐药相关，可能通过ERBB2-ERBB3旁路激活介导。

4 讨论

本研究首次将MLO相关特征系统整合于CRC预后模型构建，证实MPRS可作为TIME异质性和治疗响应的预测工具。NRG1作为兼具LLPS潜能与表观遗传调控特性的关键分子，其甲基化状态可能成为EGFR靶向治疗的生物标志物。未来需通过相分离动态成像及EGFR通路扰动实验进一步验证其功能机制，推动MLO相关标志物向临床转化。