阿洛酮糖通过致龋潜力评估平台揭示其对口腔微生物群和生物膜形成的影响

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Unveiling the impact of allulose on oral microbiota and biofilm formation via a cariogenic potential assessment platform

本研究发现，与蔗糖等传统发酵糖相比，稀有糖阿洛酮糖（D-Allulose）能显著抑制关键致龋菌变异链球菌（S. mutans）的生长、产酸及胞外多糖（EPS）合成，并维持唾液来源微生物群落的多样性，展现出其作为一种非致龋性（non-cariogenic）糖替代品的潜力，为开发口腔微生态友好型甜味剂提供了新见解。

　　

引言

人类饮食结构的演变伴随着精制碳水化合物摄入的增加，这导致了肥胖、糖尿病等代谢性疾病以及龋齿等口腔健康问题的加剧。习惯性摄入精制糖，特别是蔗糖，会通过促进菌群失调的生物膜形成和减少微生物多样性来影响口腔健康。变异链球菌（Streptococcus mutans）因其强大的生物膜形成能力和产酸特性被广泛认为是主要的病因学因素。

在可发酵的膳食糖中，蔗糖在龋齿发展中起着关键作用，显著促进了牙菌斑的积累和致病性。它是由变异链球菌分泌的葡糖基转移酶（Gtfs）催化合成胞外多糖（EPS），特别是葡聚糖的关键底物。这些EPS葡聚糖促进了细菌在牙齿表面的粘附，促进了生物膜的积累，并增强了生物膜的结构稳定性。此外，水不溶性葡聚糖将营养物和糖分捕获在生物膜内，创造了一个有利于细菌增殖的环境。

在蔗糖代谢过程中，变异链球菌产生酸性代谢物，降低了生物膜的pH值，加速了牙釉质脱矿和龋齿进展。变异链球菌在牙菌斑内的代谢活动是龋齿发展的核心。尽管生物膜内的其他微生物也可能被认为是致龋的，但变异链球菌具有几个潜在特征，如快速的膳食碳水化合物转运和发酵、酸性副产物的产生、细胞外和细胞内多糖的合成以及应激响应的碳水化合物代谢。

考虑到膳食糖在EPS合成和生物膜发展中的关键作用，减轻龋齿的努力主要集中于减少糖摄入和加强口腔卫生实践。然而，仅靠减少糖摄入并不总是可行的。因此，开发非致龋性糖替代品作为一种替代方法引起了关注。非营养性甜味剂，包括合成的和天然存在的化合物，如糖醇（多元醇），已被广泛研究，因为它们能干扰细菌代谢并抑制生物膜形成。尽管有潜力，但这些糖替代品的有效性各不相同，并可能引起胃肠道副作用，长期益处有限。

D-阿洛酮糖（D-Allulose）是一种天然存在的单糖，被归类为稀有糖，在枫糖浆、无花果干或葡萄干以及红糖中少量存在。它是通过差向异构酶处理果糖得到的差向异构体，具有蔗糖70%的甜度且热量极低。临床研究表明，摄入阿洛酮糖对代谢健康有积极影响，包括改善血浆葡萄糖控制、胰岛素调节和体重管理，对健康人群和2型糖尿病患者均显示出益处。此外，它已被美国食品药品监督管理局（FDA）普遍认为是安全的（GRAS），允许其作为食品成分使用。

临床和对照喂养研究表明，阿洛酮糖在哺乳动物系统中不能被有效代谢，但其对口腔微生物生态学（包括生物膜相互作用）的影响仍知之甚少。尽管阿洛酮糖具有前景广阔的属性，但很少有研究探讨其对口腔生物膜形成和微生物多样性的影响。在本研究中，通过一个多层次平台评估了膳食碳水化合物在各种生态模型中对口腔微生物致龋性的影响。

材料与方法

本研究采用了一个多层次的体外平台，包括单物种浮游和生物膜模型、涉及变异链球菌（致病菌）和口腔链球菌（Streptococcus oralis，共生菌）的双物种生物膜模型，以及唾液来源的微观生物膜模型。定量评估了关键毒力指标，包括细菌生长、产酸、生物膜生物量、胞外多糖（EPS）合成和微生物群落组成。

使用变异链球菌UA159（一种已确立的致龋牙科病原体和特性明确的EPS生产者）来生成单物种和多物种生物膜。为了评估不同甜味剂对变异链球菌生物膜形成和微生物动态的影响，使用了一组常见的膳食糖（如蔗糖、葡萄糖、果糖）和糖替代品（如阿洛酮糖、木糖醇和赤藓糖醇）。每种甜味剂以1%（w/v）的终浓度新鲜制备于无菌UFTYE培养基中。

通过测量OD₆₀₀在24小时内每30分钟监测一次生长，评估了浮游生长动力学。使用pH下降测定法评估变异链球菌的糖酵解产酸情况。通过qRT-PCR分析关键毒力基因（如gtfB, gtfC, gtfD, ftf, dexA, pdhA, adhE, ldh, atpD）的表达。

生物膜在唾液包被的羟基磷灰石（sHA）圆片上形成，以模拟牙釉质表面。使用SYTO 9和Alexa Fluor 647-葡聚糖缀合物对细菌和EPS进行染色，通过共聚焦显微镜检查生物膜结构。对于唾液来源的微观生物膜模型，使用来自健康个体的唾液建立初始微生物群落，并接种变异链球菌。通过16S rRNA基因测序（V3-V4区）进行宏基因组分析，以评估微生物多样性和群落结构。所有数据均以平均值±标准差表示，并使用适当的统计方法（如单因素方差分析）进行分析。

结果与讨论

浮游生长和产酸

在单物种模型中，葡萄糖和果糖支持了强劲的细菌生长，延长了指数期，并诱导了陡峭的pH下降（最终pH在30分钟内降至4.20±0.04）。相比之下，阿洛酮糖虽然结构上与果糖相似，但并未促进指数生长，仅表现出边际的产酸作用。生长在OD₆₀₀约0.3处保持稳定，pH在120分钟内保持在5.0（牙釉质脱矿的临界pH）以上，与蔗糖相比酸产量减少了99%。木糖醇和赤藓糖醇也未能支持指数生长和产酸，确立了它们作为不可发酵糖醇的作用。

毒力基因表达动力学

基因表达分析显示，在果糖存在下，gtfB和gtfC的表达显著上调，而与蔗糖相比，阿洛酮糖显著下调了gtfD的表达。编码乳酸脱氢酶的ldh基因在阿洛酮糖存在下表达显著降低，这与观察到的产酸减少相关。编码F₁F₀-ATP酶复合物β亚基的atpD在果糖存在下高表达，但在阿洛酮糖存在下显著下调，表明阿洛酮糖施加的产酸应激极小。这些发现表明，在阿洛酮糖条件下，变异链球菌表现出一种低代谢、低毒力样的状态。

生物膜形成和EPS合成

在sHA圆片模型上，蔗糖产生了显著更高的CFU计数和生物膜干重，并形成了密集的、圆顶状的微菌落，嵌入在坚实的EPS基质中。葡萄糖和果糖产生的生物量相对较少，细胞-EPS排列分散。相比之下，阿洛酮糖、木糖醇和赤藓糖醇条件下的生物膜显示出显著减少的CFU计数和干重。共聚焦成像显示，阿洛酮糖条件下的生物膜缺乏蔗糖诱导的变异链球菌优势生物膜所特有的致密EPS包裹的微菌落和圆顶状结构。

成熟生物膜的产酸潜力

对预先形成的变异链球菌生物膜进行pH下降测定，结果显示蔗糖支持最高的H⁺离子释放速率（1.95 μM/min），并在暴露20分钟内使pH降至4.5。果糖的产酸特征与蔗糖相似。相反，补充阿洛酮糖、木糖醇或赤藓糖醇的生物膜在整个测定期间保持接近中性pH，在30分钟内酸产量分别减少了98%、99%和99%。

双物种生物膜模型中的种间平衡调节

在变异链球菌（致病菌）和口腔链球菌（共生菌）的双物种生物膜模型中，补充1%蔗糖、葡萄糖或果糖选择性富集了变异链球菌，超过了口腔链球菌。这表明在富含糖和酸性的环境中，生态失衡向菌群失调状态转变。相比之下，阿洛酮糖、木糖醇和赤藓糖醇保持了平衡的微生物组成，没有出现变异链球菌相对于口腔链球菌的过度生长。这支持了非发酵性或难发酵性糖有助于减少产酸并抑制耐酸物种过度生长的观点。

唾液来源微观生物膜模型中的生态调节

在唾液包被的羟基磷灰石圆片上建立的多物种微观生物膜模型中，共聚焦成像揭示了蔗糖和阿洛酮糖补充条件下生物膜结构的显著差异。蔗糖补充的生物膜在19小时就观察到早期生物膜成熟，具有显著的细菌粘附和EPS沉积，并在43小时形成致密的圆顶状微菌落和坚实的EPS基质。相比之下，阿洛酮糖补充的生物膜显示出稀疏的细菌定植和最小的EPS沉积，生物膜结构随时间推移仍然较薄且结构性较差。

多样性分析显示，以香农指数衡量的α多样性在蔗糖补充的生物膜中显著低于无糖添加对照组和阿洛酮糖补充的生物膜。阿洛酮糖在19小时和43小时都保持了最高的香农多样性指数。基于Bray-Curtis距离的β多样性分析（主坐标分析）显示，微生物群落按处理和时间点明显聚类。蔗糖处理的生物膜与阿洛酮糖补充和无糖添加对照生物膜强烈分离，表明微生物群落组成向菌群失调状态显著转变。相比之下，阿洛酮糖处理的群落更接近于无糖添加对照群落，表明其维持了更健康兼容的微生物群落。

在属水平上，蔗糖显著降低了群落多样性，选择性促进了产酸和耐酸的链球菌属（Streptococcus）和乳杆菌属（Lactobacillus）的生长。相反，阿洛酮糖补充维持或增加了健康兼容菌属的相对丰度，如奈瑟菌属（Neisseria）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、韦荣球菌属（Veillonella）和颗粒链菌属（Granulicatella）。韦荣球菌可将链球菌等发酵菌产生的乳酸转化为弱酸，可能降低牙釉质脱矿速率。此外，阿洛酮糖组中梭杆菌属（Fusobacterium）的存在表明了多样的微生物群落结构，其中微生物连通性和平衡得以保持。

讨论

本研究使用多层次平台研究了阿洛酮糖对口腔生物膜发展的生态和功能影响。通过生物学相关模型，系统性地表明阿洛酮糖不支持常见发酵糖（如蔗糖、果糖和葡萄糖）通常促进的关键毒力特征。与发酵糖相比，阿洛酮糖 consistently 导致更低的生长、产酸性和EPS基质形成，同时保持了共生菌（口腔链球菌）的生态平衡。在唾液来源的微观模型中，阿洛酮糖处理保持了更高的微生物多样性，并保留了健康兼容的菌属，表明微生物平衡和生态恢复力。

这些发现表明，在体外条件下，阿洛酮糖是一种微生物组友好的糖替代品，可以限制致龋性转变。然而，将阿洛酮糖作为已确立的防龋剂（如木糖醇和赤藓糖醇）的替代品的转化潜力需要进一步研究。

本研究承认该平台的局限性，特别是连续糖暴露模型无法准确模拟膳食摄入的动态性。未来的研究应旨在通过纳入"盛宴-饥荒"策略来提高致龋性评估的生态相关性。此外，未来的研究应评估牙菌斑成分、唾液pH动态以及随时间推移的龋齿发生率，以通过体内模型（包括临床试验）验证这些体外结果。关于阿洛酮糖与氟化物、口腔益生元或益生菌相互作用的研究也可能阐明口腔微生物群的生态工程。总体而言，本研究为开发支持口腔和全身健康的下一代微生物组意识型糖替代品奠定了坚实的基础。