综述：活细胞成像荧光细胞周期报告基因简明指南

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：A concise guide to fluorescent cell cycle reporters for live-cell imaging

这篇综述系统梳理了用于活细胞成像的荧光细胞周期报告基因，重点介绍了FUCCI、激酶易位报告基因（KTR）和基于DNA复制灶的PCNA报告系统。文章深入分析了各类报告基因的设计原理、优势与局限性，并展望了多报告基因联用策略在解析细胞周期调控、应激响应及疾病相关通路（如CDK、APC/CCdh1）中的前沿应用，为研究者选择合适工具提供了精准指导。

　　

活细胞成像荧光细胞周期报告基因简明指南

细胞周期是生物体生长和维持稳定的基本过程，其失调与多种人类疾病尤其是癌症密切相关。因此，监测细胞周期动态对于生物学研究至关重要。传统的细胞周期分析方法，如流式细胞术和药物同步化方法，存在时间分辨率低或干扰细胞正常生理状态等局限。近年来，基因编码的荧光细胞周期报告基因已成为在活细胞中以单细胞分辨率实时研究细胞周期的强大工具。

引言

细胞周期确保遗传物质精确复制并分配到两个子细胞中，这一过程对于发育、组织修复和机体稳定至关重要。细胞周期调控失常与先天性疾病和癌症等人类疾病相关联。基于时间推移成像技术和计算图像分析方法的进步，使得在活细胞中实时监测细胞周期状态成为可能。各类荧光细胞周期报告基因，如荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）、激酶易位报告基因（KTR）和基于DNA复制灶的报告系统应运而生，它们通过监测不同的细胞周期特异性过程来判定细胞周期状态。

The FUCCI系统

荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）系统是首个用于可视化细胞周期转换的基因编码荧光报告基因，自2008年推出以来被广泛应用于体外和体内研究。FUCCI系统基于两种关键蛋白Cdt1和Geminin的细胞周期依赖性降解。Cdt1参与DNA复制调控，而Geminin是DNA复制的抑制剂。这些蛋白分别被在G1期和S/G2/M期活跃的特异性E3泛素连接酶复合物APC^Cdh1和SCF^Skp2靶向降解。通过将负责细胞周期特异性降解的肽段与荧光蛋白融合，实现了细胞周期阶段的特异性标记。在G1期，mKusabiraOrange2-hCdt1 (30/120)积累；在S/G2/M期，mAzamiGreen-hGem (1/110)积累；在G1/S转换期，由于信号重叠呈现黄色荧光。

FUCCI系统依赖于高度保守的通过泛素介导的蛋白水解进行的细胞周期转录后调控，这使得FUCCI构建体可在多种细胞类型中表达并保持特异性，也便于在转基因动物中稳定长期表达，适用于发育生物学和癌症研究。此外，基于FUCCI荧光强度的读数与荧光激活细胞分选（FACS）兼容，可用于富集同步化的细胞群体进行转录组和蛋白质组分析。

Limitations of the original FUCCI system

然而，原始FUCCI系统存在一些局限。它无法区分S期和G2期，因为Geminin在两个阶段都保持稳定；同时也不能区分G0期和G1期。此外，原始FUCCI报告基因基于人的降解基序设计，依赖于SCF^Skp2和APC^Cdh1的活性，在斑马鱼、果蝇等模式生物中，由于降解通路存在差异，需要开发物种特异性的FUCCI变体。报告基因递送方法（如慢病毒转导）导致的表达水平变异也是一个技术挑战。

Advancements in FUCCI design

为了克服原始设计的局限，多种改进的FUCCI变体被开发出来。FUCCI2采用了更亮的荧光蛋白（如mCherry, mVenus）以增强信号强度。PIP-FUCCI使用Cdt1的PIP降解基元（1–17）替代Cdt1（30–120），以改善G1期和G2/M期的区分精度。FUCCI4进一步扩展了系统，增加了荧光标记的组蛋白H1.0来检测M期，以及SLBP(18–126)来区分S期向G2期的转换，从而能够识别所有四个主要细胞周期时相（G1, S, G2, M）。物种特异性适配体，如zFUCCI（用于斑马鱼）和Fly-FUCCI（用于果蝇），拓宽了FUCCI在非哺乳动物模型中的应用。特别值得注意的是FUCCI(CA)，它引入了对CUL4^Ddb1敏感的降解基元，并将保守的RRL基序突变为AAA以避免SCF^Skp2依赖性降解，从而在哺乳动物系统中能更好地区分G1、S和G2期。

Kinase translocation reporters (KTRs)

激酶易位报告基因（KTRs）是一类基因编码的生物传感器，通过将磷酸化事件转化为亚细胞定位的变化来实时检测激酶活性。与FUCCI等通过检测蛋白降解来推断细胞周期时相的报告基因不同，KTRs通过测量细胞周期调控因子如细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的活性来间接判断细胞周期状态。

典型的KTR包含一个激酶特异性底物基序，两侧 flanked by 核定位信号（NLS）和核输出信号（NES），并与一个荧光报告蛋白融合。在未磷酸化状态下，报告基因因显性NLS活性而定位于细胞核。当被特定激酶磷酸化后，引入的负电荷会破坏核输入并增强NES介导的核输出，导致报告基因在细胞质中积累。通过测量细胞质与细胞核的荧光强度比，可以高时间分辨率地推断激酶活性动态。

基于人DNA解旋酶B（HDHB）的CDK2报告基因是细胞周期研究中广泛使用的KTR实例。HDHB在其C端区域的多个CDK靶点（最显著的是丝氨酸967）处受到磷酸化调控，这导致HDHB片段响应CDK2活性在细胞核和细胞质之间穿梭。除了CDK2，还开发了用于其他关键细胞周期激酶（如CDK4/6）的KTRs。KTRs的模块化特性允许轻松更换荧光标签，以实现多重成像。

Limitations and considerations of KTRs

KTRs的应用也存在一些限制。准确的信号量化依赖于清晰的核质区域分离，需要高分辨率成像和可靠的核标记。在形状不规则的细胞类型中，精确追踪核质易位变得困难。核膜破裂也会干扰基于定位的信号分析。KTR的特异性可能受到激酶串扰的影响，例如CDK2已被报道可磷酸化ERK和p38 KTRs，导致假阳性易位事件。此外，虽然KTRs提供激酶活性的实时读数，但这些信号通常是连续谱，使得仅凭KTR信号准确区分S期和G2期等时相具有挑战性，往往需要额外的荧光报告基因来精确定位S期进入。

DNA replication foci based cell cycle reporters

基于DNA复制灶的报告基因利用DNA复制机器的时空组织来监测S期进程。这些系统通常采用与复制叉相关的荧光标记蛋白，如增殖细胞核抗原（PCNA）。PCNA是一个保守蛋白，在复制叉处形成环绕DNA的环状结构，聚集DNA合成所需的蛋白质。由于PCNA在细胞周期中表现出不同的亚核定位模式，它已被用作活细胞中监测DNA复制动态的荧光报告基因。通过追踪活细胞中复制灶的形成和溶解，研究人员可以实时界定DNA复制的开始、进展和完成。

使用基于PCNA的报告基因有几个关键优势。PCNA在弥漫性核存在和复制灶之间的快速可逆转换，为S期进程提供了高度敏感且时间精确的标志。由于S期进入的判断依赖于PCNA从弥漫状态到点状状态的空间重分布，光漂白对荧光强度的影响对PCNA报告基因确定细胞周期阶段的可靠性影响有限。此外，开发出的可识别内源性PCNA的细胞渗透性荧光标记纳米抗体，无需建立稳定的荧光细胞系即可可视化PCNA动态。

Limitations and considerations of employing fluorescent PCNA reporters

PCNA报告基因也有其局限性。早期全长PCNA的过表达实验表明，PCNA过表达会影响细胞周期进程，导致复制应激增加、生长控制破坏，并可能促进恶性细胞转化。因此，使用干扰较小的方法，如内源性荧光标记的PCNA或荧光标记的PCNA纳米抗体，对于减少对细胞周期自然动态的干扰至关重要。PCNA的功能不仅限于DNA复制，它还参与DNA修复过程。在基因毒性应激下，PCNA可在S期外形成焦点以促进DNA修复，而复制进程停滞事件（如使用阿非迪霉素）会限制PCNA灶的形成，这可能使复制特异性信号的解读复杂化。此外，PCNA从弥漫到点状灶的动态定位模式对图像分析中的灶点检测和核分割提出了挑战，通常需要额外的核标记或先进的深度学习图像分析方法来实现可靠的自动分割和细胞周期分类。

Future perspectives

尽管单个细胞周期报告基因非常有用，但在捕捉细胞周期动态的全部复杂性，尤其是在细胞应激条件下，可能不足。不同的报告基因基于测量的生物学特性不同，可能得出相互矛盾的细胞周期时相结果。例如，在复制应激或DNA损伤诱导下，基于DNA复制灶的PCNA报告基因和CDK2 KTR特异的HDHB报告基因可能产生不一致的结果。

组合多种荧光报告基因为理解复杂调控机制提供了优势，这是单一报告基因无法完全解决的。例如，将CDK2活性传感器与FUCCI报告基因中的Cdt1或Geminin片段组件整合，能够精确确定G1/S转换。多报告基因策略也可用于研究各种激酶的细胞间信号如何影响细胞周期转换。这些方法不仅提高了细胞周期转换的时间和空间分辨率，还减少了由标记物行为变化引起的误读。

Conclusion

基因编码的荧光细胞周期报告基因为在活细胞中精确研究细胞周期动态提供了强大的工具包。然而，选择最合适的报告基因至关重要，需根据具体的生物学实验慎重考虑，因为某些报告基因可能不是最优或不适用的。多报告基因策略的近期实践展示了这些细胞周期报告基因的扩展效用。通过精心选择最佳报告基因并采用能检测细胞周期进程不同且互补方面的多报告基因策略，研究人员可以克服单一报告基因的局限性。这些报告基因正在改变我们研究细胞周期的方式，并揭示关于控制细胞命运和功能的基本过程的新见解。