土耳其农村地区人群、动物及环境中芽囊原虫的分布特征及其与人类肠道微生物组的关联研究

《Frontiers in Microbiology》：Blastocystis across humans, animals and the environment in rural Türkiye, and relationships with the human intestinal microbiome

本综述通过整合寄生虫学、微生物组与环境分析，系统揭示了土耳其农村地区人群、动物（牛、羊、山羊）及环境样本（水、泥）中芽囊原虫（Blastocystis）的高流行率（人群76.6%，牲畜71-78%，环境38%）及其亚型（ST）多样性。研究发现体重指数（BMI）与芽囊原虫定植显著相关，且ST4亚型携带者表现出独特的肠道菌群特征（如细菌多样性降低、拟杆菌门（Bacteroidota）丰度下降）。研究首次在土耳其牲畜中报道了ST25、ST26等亚型，强调了“一体化健康”（One Health）研究框架对阐明该原生生物生态作用及潜在健康意义的重要性。

　　

引言

芽囊原虫（Blastocystis）是一种在全球范围内普遍存在的肠道原生生物，常见于人类和多种动物（包括哺乳动物、鸟类和爬行动物）的肠道中。它是已知的两种栖息于人类肠道的茸鞭生物（stramenopiles）之一。尽管其广泛存在，但它在健康与疾病中的作用仍不明确，这使其成为持续研究的主题。

该生物体以多种形态存在——空泡型、颗粒型、阿米巴样、包裹型，以及较少见的无空泡型和多空泡型——通过粪便中排出的包裹以粪-口途径传播。据估计，芽囊原虫在全球定植了近十亿人，其流行率在发达地区为5%–20%，在发展中地区超过30%。对不同地理区域人群的研究表明，芽囊原虫定植与独特的肠道微生物谱和较高的微生物多样性相关。它还与有益细菌类群（如瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）和普雷沃菌属（Prevotella））丰度的增加有关。这与通常在胃肠道疾病（如炎症性肠病）患者中观察到的微生物多样性减少形成对比。此外，据报道芽囊原虫与健康的饮食模式、较低的肥胖率、心血管代谢风险和死亡率相关。这些发现表明芽囊原虫可能是健康肠道微生物群的指标，尽管其潜在作用机制仍然未知。

基于SSU rRNA的多样性，已鉴定出至少44个芽囊原虫亚型（ST）。其中，包括ST1–ST10、ST12、ST14、ST16、ST23、ST35和ST41在内的16个亚型已在人类中发现，其中ST1–ST4是最常报告的。在土耳其，芽囊原虫的流行率在不同研究中从2.1%到51%不等，其中ST3（47.9%）是优势亚型。对牲畜（即牛、羊、水牛和鸡）和伴侣动物（即狗、猫和马）以及环境来源的研究表明携带率从3.65%到超过60%，但其传播动力学仍知之甚少。

最近的数据表明体重指数（BMI）与芽囊原虫定植存在相互作用，几项研究报告了瘦个体中芽囊原虫存在率较高，而一项研究发现肥胖个体中芽囊原虫流行率较高（尽管肥胖样本量较小）。其他研究报告肥胖人群中的流行率超过40%，但缺乏瘦对照组限制了结果的解释。

人畜共患传播研究表明某些亚型可能在人类和动物之间传播，但尚不清楚这些相同菌株是建立了定植还是仅仅是暂时存在。最近的研究报告了土壤中芽囊原虫的分子检测，某些亚型在人类和环境样本中共享。这些发现表明土壤是一种传播途径，为其传播增加了另一层复杂性。因此，采用综合考虑人类、动物和环境的整合方法对于阐明该生物的流行病学至关重要。第一项在此背景下调查芽囊原虫发生的研究在泰国的一个农村社区进行。然而，来自不同地区的研究对于评估潜在的地理或农村/城市差异至关重要。为填补这一空白，我们在土耳其的一个农村地区进行了一项研究。我们旨在利用显微镜和分子方法探索来自克勒克勒村塞汉湖大坝湖区的人类、牲畜（牛、羊、山羊）和环境样本中芽囊原虫的多样性、分布和可能的传播动力学。此外，我们调查了芽囊原虫定植与人类肠道微生物群组成之间的关系。

材料与方法

这是一项横断面研究，于2023年10月至11月期间在阿达纳省塞汉湖大坝盆地的克勒克勒村进行。收集了人类、动物（牛、羊、山羊）和环境（水和泥）样本，并使用显微镜和分子方法进行分析。

伦理声明与研究许可：丘库罗瓦大学的伦理委员会批准了本研究的样本收集和微生物组分析。伦理规则遵循《赫尔辛基宣言》。所有参与者都被告知了项目的性质。获得了参与者及其儿童参与者父母的签署同意。对于环境样本，从阿达纳省省长和卡拉萨利区农业和林业局获得了使用大坝湖材料的研究许可。

研究区域：本研究在土耳其阿达纳省卡拉萨利区的克勒克勒村进行，该村人口582人，距离市中心35公里。该村位于地中海气候区，夏季炎热干燥，冬季温和多雨。该定居点的居民以农业和畜牧业为生，周围环绕着农田、森林斑块、牧场和塞汉湖大坝的支流。季节性动物迁徙在该村周围地区很常见。塞汉大坝建于约70年前，距离克勒克勒村12公里。塞汉湖大坝穿过研究区域的村庄边界，用于灌溉农田和牲畜。水位在11月和12月消退。因此，该区域可用于休闲活动，如野餐和露营。它也用作放牧牲畜的牧场，动物在那里排便。由于融雪，该区域在4月和5月再次充满水。该地区因其地理位置、气候、靠近塞汉湖大坝（用于牲畜饮水和田间灌溉）、大量的动物种群、丰富的牧场以及主要从事农业和畜牧业的人口而被选为“一体化健康”方法的示范点。此外，该地区有潜力代表肠道寄生虫的人-动物-环境循环。

样本收集：人类、动物（牛、羊和山羊）和环境样本被收集并保存在DNA/RNA Shield?中以供进一步分析。

人类粪便样本：采用生物学研究中常用的“目的性抽样方法”来确定本研究的人类样本数量。所有参与者看起来都很健康，没有腹泻或血便病例。从64个家庭的124名参与者中随机收集样本。其中，90名参与者来自从事畜牧业的家庭，另外34名参与者来自没有动物的家庭，并报告至少6个月内未饲养任何动物。这两组根据是否从事畜牧业进行评估。没有腹泻或血便病例。向每位参与者提供了一个标记好的无菌粪便收集容器。

动物粪便样本：从参与研究的个体的89头牛、151只羊和65只山羊中总共收集了305份粪便样本。每只动物的样本数量使用“比例分层抽样方法”计算。因此，每个家庭抽样的动物数量根据该家庭的动物数量而有所不同。为尽量减少环境污染，样本是通过在早晨喂养、梳理或休息时直接观察动物排便来收集的，确保每只动物只收集一份样本。单个样本收集在预标记的容器中。

环境样本：从塞汉湖大坝最靠近人类活动（野餐、露营、钓鱼等）和动物放牧发生的部分，以及用于牲畜和农业用途的灌溉区域直接收集了24份大坝湖水和16份泥浆样本。水样本从大坝湖、其支流和积水处用1升无菌容器收集。这些样本在室温下的平坦表面静置过夜，然后用手动排水系统排出上清液，直到剩下50毫升沉淀物。然后将沉淀物转移到15毫升管中，以500 g离心10分钟，排出上清液，将底部剩余的沉淀物保存在DNA/RNA Shield?中直至进一步分析。泥浆样本从上述地点采集，并直接保存在DNA/RNA Shield?中直至进一步分析。

芽囊原虫筛查：

培养：从所有粪便样本中取约200毫克接种到含有10%马血清的Jones培养基中。同样，处理水和泥浆样本获得的沉淀物也接种到培养基中。在37°C培养48-72小时后，使用光学显微镜检查培养样本以确定是否存在芽囊原虫。

基因组DNA提取：取200 μl彻底涡旋的DNA/RNA Shield-样本混合物，使用PureLink? Microbiome DNA Purification Kit按照制造商的方案进行DNA提取。

qPCR（实时荧光定量PCR）：使用特异性引物序列（BL18SPPF1和BL18SR2PP）扩增SSU rRNA基因的保守区域（330 bp）通过qPCR鉴定芽囊原虫。每个qPCR运行中都使用阴性对照（无核酸酶水）和阳性对照（芽囊原虫基因组DNA）。反应混合物包含Luna Taq Universal、10 μM引物对和模板DNA。qPCR方案包括：预变性步骤：95°C 5分钟；随后进行49个循环的变性步骤：95°C 5秒，退火步骤68°C 10秒，延伸步骤72°C 15秒；最后延伸72°C 10分钟。反应在96孔板中设置，使用CFX96 Touch实时荧光定量PCR检测系统进行。

聚合酶链式反应和系统发育分析：对通过培养（显微镜检查）或qPCR方法呈芽囊原虫阳性的样本进行巢式PCR。巢式PCR的引物寡核苷酸序列在补充表1中详述。第一轮和第二轮PCR方案设置如下：预变性步骤：95°C 5分钟；30个循环：变性步骤：94°C 1分钟；退火步骤：第一轮和第二轮PCR分别为59°C和50°C，持续1分钟；延伸步骤：72°C 1分钟；最后延伸步骤：72°C 10分钟。使用内部引物对每个第二轮PCR阳性样本进行DNA测序。

通过Sanger测序获得的序列经过手动检查，并用作查询在NCBI中进行BLAST搜索，与参考基因序列进行比较。为了进行系统发育分析，构建了一个涵盖芽囊原虫多样性以及新获得序列的数据集。为避免冗余，将高度相似的序列（差异度<98%）分组折叠，数据集中仅包含一个或两个代表序列。使用MUSCLE v5进行序列比对。使用Trimal v1.4去除模糊位置。使用IQTREE进行最大似然分析。

微生物组测序：高通量扩增子测序外包给Novogene，遵循Caporaso等人描述的方案的修改版本。使用1 ng提取的DNA，进行片段化并适用于双端测序。使用引物对515F和907R扩增16S rRNA基因，该引物靶向V3-V4高变区。测序在Illumina NovaSeq平台上进行。

使用Lotus2流程处理原始测序读数。工作流程包括几个关键步骤：使用Minimap2进行嵌合体检测和去除，该软件还用于通过针对基因组参考联盟人类构建38.p14进行BLAST搜索来识别和排除脱靶人类DNA读数（检测到0个污染样本）。然后使用分裂扩增子降噪算法2（DADA2）将修剪后的读数聚类成扩增子序列变体（ASV），最大允许一个核苷酸差异。通过针对GreenGenes2（GG2）数据库进行BLAST搜索对ASV进行物种分类。

统计分析：使用IBM SPSS统计软件版本29对研究中获得的数据进行统计分析。使用全局卡方检验评估性别和年龄组（0-18岁、19-39岁、40-59岁、60岁及以上）的分布是否存在显著差异（p < 0.05）。对于微生物组分析，使用Shapiro-Wilk检验评估数据分布的正态性。正态分布的数据使用ANOVA分析，然后进行Tukey's HSD检验进行成对比较。对于非正态分布的数据，应用Kruskal-Wallis检验，然后进行Dunn检验（经Bonferroni调整）进行多重比较。

使用R Studio 4.2.3进行统计分析和数据可视化。为了考虑测序深度的变化，首先基于物种累积曲线将数据稀释至60,000条读数。稀释导致排除一个样本。然后计算每个样本中每个属的相对丰度，并生成热图以可视化结果。使用Phyloseq包中实现的多样性指数（包括Shannon和Simpson）和丰富度估计量（包括Chao1和观察到的分类单元）评估Alpha多样性。比较芽囊原虫阳性和阴性样本之间的这些指数。为了可视化微生物组组成，使用Microbiome包生成组成条形图，仅包含占总读数1%以上的分类单元。基于Bray-Curtis相异性的主坐标分析（PCoA）用于可视化芽囊原虫阳性和阴性样本之间微生物群落结构的差异。使用Bray-Curtis相异性矩阵绘制样本图。使用PERMANOVA检验组间差异的统计学显著性。应用线性判别分析效应量（LEfSe）来识别基于相对丰度谱区分芽囊原虫阳性和阴性样本的潜在生物标志物。绝对值大于2的线性判别分析（LDA）得分被认为是判别性特征的指标。

结果

人类参与者的人口学特征：研究的124名参与者中，58名（46.8%）为女性，66名（53.2%）为男性，平均年龄44.7岁（范围6至82岁）。参与者中，90名（72.6%）积极参与畜牧业，34名（27.4%）声明至少最近6个月内未参与照料任何动物。此外，所有参与者声明饮用自来水。为所有19岁及以上的参与者计算了体重指数（BMI）。参与研究的个体中95名（87.2%）BMI超过25，被归类为超重或肥胖。其余参与者被归类为正常体重（18.5–24.9）。研究中没有极度体重不足（BMI < 18.5）的个体。参与者根据芽囊原虫存在情况的社会人口学特征分布如表1所示。更详细的表格见补充表1。

芽囊原虫检出情况：本研究使用培养和qPCR调查了所有样本类型中芽囊原虫的存在。当在培养物中显微镜下观察到芽囊原虫或获得序列（qPCR产物或PCR产物）时，样本被视为阳性。因此，仅显微镜检查阳性的样本包含在流行率计算中，但不进行亚型分型。在所有情况下，显微镜下主要观察到空泡型，偶尔观察到颗粒型和阿米巴样型。在人类样本中，培养阳性率为70.1%（87/124）。关于qPCR，124份样本中有111份产生了预期大小的条带，但其中只有36份样本成功测序和分型。28份样本通过显微镜和分子方法均为阳性。结合两种方法，本研究中人类的总体阳性率为76.6%（95/124）。0-18岁年龄组的阳性率为66.7%（10/15），19-39岁组为80.8%（21/26），40-59岁组为76.3%（45/59），60岁以上组为75%（18/24）。统计分析显示BMI与芽囊原虫阳性之间存在显著关联（p < 0.05）。虽然芽囊原虫在BMI正常的个体中更为普遍，但未在亚组水平进行统计检验。全局卡方检验显示芽囊原虫阳性与其他人口统计学变量（如性别、职业和年龄组）之间无统计学显著关系（p > 0.05）。

在动物中，培养阳性率为66%（200/304）。更具体地说，牛的培养阳性率为65.2%（58/89），羊为66.2%（100/151），山羊为64.6%（42/65）。使用qPCR，100%的样本显示出预期大小的条带。其中，77份成功测序和分型（24头牛，35只羊，17只山羊）。结合两种方法，阳性率在牛中为71%（63/89），在羊中为73%（110/151），在山羊中为78%（50/64）。

环境样本仅通过培养显示37.5%（15/40）的阳性率。其中11份是水样本，4份是泥浆样本。所有环境样本均未获得芽囊原虫序列。

芽囊原虫亚型：总共对来自人类（n=36）、牛（n=24）、羊（n=35）和山羊（n=17）的112条序列进行了亚型分型。在多个实例中，色谱图显示混合感染的证据，如多重峰所示。为了分配亚型，遵循以下标准：质量合理、长度超过300 bp且在GenBank中相似性超过98%的序列。使用系统发育学和针对GenBank以及权威数据库pubmlst的BLAST相结合的方法鉴定亚型。在系统发育分析中，所有亚型都是单系的，新序列置于已知的亚型进化枝内。对于18条序列，方法学结果不一致。在pubmlst中，它们被鉴定为属于先前包含ST10的亚型之一（即ST23，ST42-ST44），这可能是由于序列较短。在系统发育树中，这些序列置于过去包含ST10的进化枝内，但根据分类单元取样在进化枝内跳跃。其中13条来自牛，3条来自羊，2条来自山羊。这些序列未被分配亚型，仅标注了它们聚集的进化枝。

总共鉴定出13种亚型：ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST10、ST21、ST24、ST25、ST26、ST42、ST43和ST44。在人类中，检测到四种亚型，即ST1、ST2、ST3和ST4。最丰富的亚型是ST3（33%，12/36），其次是ST1和ST2（各占31%，11/36）以及ST4（6%，2/36）。在动物中，检测到十种亚型：ST4、ST5、ST10、ST21、ST24、ST25、ST26、ST42、ST43和ST44。在牛中，鉴定出ST10（n=8）、ST25（n=2）、ST26（n=3）、ST42（n=5）、ST43（n=1）和ST44（n=5）。在羊中，检测到ST4（n=1）、ST5（n=2）、ST10（n=17）、ST24（n=5）、ST26（n=4）、ST43（n=3）和ST44（n=3）。山羊样本对ST10（n=5）、ST21（n=2）、ST24（n=7）、ST26（n=1）、ST43（n=1）和ST44（n=1）呈阳性。表2显示了芽囊原虫亚型在人类和动物宿主中的分布。ST10在牛和羊中最丰富，而在山羊中ST24最丰富。ST10、ST26、ST43和ST44由所有三种反刍动物共享（图2）。ST25和ST42仅在牛中检测到，而ST21仅在山羊中检测到。ST24在山羊和羊中检测到，但未在牛中检测到。

在家庭层面，对五个家庭中多个个体进行了亚型分析，同一家庭内的个体之间未发现共同的亚型（ST）。然而，在同一家庭的牲畜中报告了共同的亚型。

微生物组分析：使用Shannon（图3A）、Simpson（图3B）、Chao1（图3C）和观察到的分类单元（图3D）指数，芽囊原虫阳性样本和阴性样本之间的细菌Alpha多样性没有显著差异，这通过ANOVA/Kruskal-Wallis检验证实。然后在亚型水平（ST1-ST4）比较了相同的指标（图3E-H）。相对于芽囊原虫阴性样本，ST1在所有指标上的平均多样性得分最高，而ST4样本显示出多样性和丰富度较低的趋势，但这些结果不显著。按芽囊原虫存在情况分组的样本组成比较如图4所示（单个样本显示在补充图2中）。在属水平上，芽囊原虫阳性样本的普雷沃菌属（Prevotella）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）相对丰度较高，而毛螺菌科（Lachnospiraceae）相对减少（图4A）。当样本按亚型分组时，ST4的普雷沃菌属显著减少，双歧杆菌属显著增加，同时阿加索杆菌属（Agathobacter）增加（图4B）。在门水平上，芽囊原虫阳性样本显示拟杆菌门（Bacteroidota）增加而变形菌门（Proteobacteria）减少（图4C）。当样本按芽囊原虫亚型分组时，ST4显示拟杆菌门的相对丰度显著降低，而放线菌门（Actinobacteriota）增加（图4D）。为了评估整体细菌群落组成的差异，使用了基于Bray-Curtis相异性的主坐标分析（PCoA）（图5）。PERMANOVA检验表明，芽囊原虫阳性组和阴性组之间的群落结构存在显著差异，尽管效应量较小（p = 0.037，R2 = 0.046）（图5A）。当样本按芽囊原虫亚型分组时（图5B），PERMANOVA检验也揭示了群落组成的显著差异（p = 0.03，R2 = 0.136），表明与单纯定植状态相比效应量更强。使用配对Adonis评估组间群落组成的差异。观察到ST3和芽囊原虫阴性样本之间存在显著差异（补充表2）。为了识别与芽囊原虫定植状态相关的分类单元，使用了线性判别分析效应量（LEfSe）。绝对值大于2的线性判别分析（LDA）得分被认为是判别性特征的指标。分类单元汇总到属和科水平（图6）。具有高LDA得分的分类单元对区分芽囊原虫阳性和阴性样本贡献最大。总共鉴定出38个属对芽囊原虫阴性样本具有判别性，而13个属对芽囊原虫阳性样本具有判别性。在科水平上，这些数字分别为5和13。

讨论

本研究首次对土耳其农村地区的芽囊原虫进行了整合性调查，检查了人类、牲畜和环境样本，以评估其流行率、亚型分布和肠道微生物组组成。人类参与者的人体测量数据显示，BMI与芽囊原虫定植之间存在显著关联，这与之前的研究一致，瘦个体的芽囊原虫阳性率最高。少数研究发现肥胖个体中芽囊原虫发生率较高。然而，该生物的存在与改善心血管代谢健康特征的细菌类群相关，并且在肥胖个体中与较低的代谢综合征发生率相关。此外，芽囊原虫定植与肠道炎症无关，如较低的粪便钙卫蛋白水平所示。总的来说，这些发现支持了芽囊原虫在肠道生态系统中有益作用的假设，并值得进一步探索以了解其贡献和潜在机制。

我们的结果表明，在所有研究的宿主物种中芽囊原虫的发生率都很高，这与其他农村社区的研究结果一致。然而，真实发生率可能被低估，因为几份显微镜检查阴性的样本明显芽囊原虫阳性，但由于测序质量差而被排除。此外，仅显微镜检查阳性的几份样本也未能成功扩增或测序。动物和环境样本尤其如此。一个主要问题是缺乏从环境样本中进行芽囊原虫qPCR的标准化方法。可能导致这种情况的其他解释包括潜在的扩增抑制和混合感染。优化环境DNA方法学至关重要，可以显著提高我们对生态储库和传播途径的理解。

总共鉴定出13种亚型，表明采样区域及相关宿主具有高度的遗传多样性。人类主要携带ST1、ST2和ST3亚型，这与全球人类相关亚型分布一致。牲畜（全部为反刍动物：牛、羊、山羊）携带了这些动物的典型亚型。在社区和家庭层面观察时，人类与其动物之间几乎没有亚型共享。这一发现似乎与支持芽囊原虫人畜共患传播证据的其他几项研究不符。但值得注意的是，确诊的人畜共患病例总体比例仍然很低；在几乎所有的研究中，只有一小部分人类与动物共享相同的亚型。因此，即使人畜共患传播是可能的，它在所研究人群中似乎也不常见。另一种解释可能是环境暴露。先前在环境样本中检测到芽囊原虫，最近专注于亚型分型的研究揭示了此类样本中存在广泛的亚型。在此，我们在水和/或土壤样本中检测到芽囊原虫；然而，测序失败阻止了亚型鉴定。总的来说，这些发现指向环境在驱动芽囊原虫传播中起作用。然而，这一途径的研究相对较少，值得进一步调查。

芽囊原虫定植与独特的肠道微生物谱相关，其特征是微生物多样性增加和细菌物种丰富度提高。这些研究大多考虑了芽囊原虫的存在或不存在，相对较少探索亚型间的差异。我们的分析揭示了亚型特异性的结构，表明携带不同亚型的个体具有不同的微生物群落，这与之前的发现一致。在这项研究中，ST4尤为突出，因为它显示出微生物多样性和丰富度较低的趋势，这与早期研究相反。值得注意的是，在这些研究中，几乎所有的ST4阳性样本（除两个来自亚洲外）都起源于西方化人群，主要来自欧洲。这表明ST4-微生物群关联可能因人群或环境而异。或者，这种差异可能是由于本研究中ST4个体数量较少所致。无论如何，这一发现强调了研究不同人群、关注芽囊原虫亚型水平差异的必要性。

本研究存在一定的局限性。首先，横断面设计无法评估时间关系。虽然揭示了BMI与芽囊原虫携带之间的显著关联，但检验并未确定三个BMI组别之间的差异是否是这一发现的基础，因为未考虑其他潜在的混杂因素（例如，饮食、共存疾病）。

结论

本研究不仅通过描述土耳其农村环境中人类和牲畜的芽囊原虫亚型多样性来弥合知识空白，而且开创了该地区整合性“一体化健康”调查的模式。通过结合经典寄生虫学、微生物组分析，我们证明了此类框架的可行性和价值。这些发现为未来在土耳其境内及全球类似农村社区进行纵向和比较研究奠定了基础。额外的多学科合作研究将有助于重新定义我们对肠道原生生物的理解——不仅仅是作为病原体，而是作为宿主健康和环境生态系统中复杂的微生物参与者。